一种干血斑中维生素D含量的检测方法技术

本发明专利技术提供一种干血斑中维生素D含量的检测方法，所述方法采用超纯水浸润血斑，乙腈提取待测物并沉淀杂质蛋白，PTAD衍生放大信号，完成样本的前处理。同时，采用LC‑ESI‑MS/MS方法完成两种25羟基维生素D的同时检测，用时3分钟。本发明专利技术采用的前处理方法体系微小、液质检测方法用时短，均使得有机溶剂使用量大幅减少，环保节能，可用于大规模临床推广，商业化价值高。

Method for detecting vitamin D content in dried blood spots

The present invention provides a method for detecting the content of vitamin D in dried blood spots, the method of using ultra pure water infiltrating blood spots, acetonitrile extraction analytes and precipitated protein impurities, PTAD derived signal amplification, complete sample pretreatment. At the same time, the two kinds of detection of 25 hydroxy vitamin D and the LC ESI MS/MS method, with a time of 3 minutes. The prior treatment method adopted by the invention has the advantages of small system and liquid detection method and short use time, greatly reducing the use of organic solvent, protecting environment and saving energy, and can be used for large-scale clinical promotion and high commercial value.

【技术实现步骤摘要】
一种干血斑中维生素D含量的检测方法
本专利技术属于化学分析
，涉及一种干血斑中维生素D含量的检测方法。
技术介绍
维生素D[VitaminD(VD)]是一种脂溶性维生素，主要包括植物源的维生素D2和阳光照射合成的维生素D3，二者的生物活性具有差异，需要同时监控。25-羟基维生素D是维生素D在人体内的主要存储形式，是临床检测评价维生素D营养状况的最佳指标(BunchDR,MillerAY,WangS.Developmentandvalidationofaliquidchromatography-tandemmassspectrometryassayforserum25-hydroxyvitaminD2/D3usingaturbulentflowonlineextractiontechnology.[J].ClinicalChemistry&LaboratoryMedicine,2009,47(12):1565-72.)。维生素D可以帮助人体利用钙磷，强健骨骼(MüllerDN,KleinewietfeldM,KvakanH.VitaminDreview.[J].JournalofRenin-Angiotensin-AldosteroneSystem,2011,12(2):125-8.)。人体内维生素D水平若长期处于异常水平，会导致各种疾病。维生素D缺乏可能导致儿童佝偻病，也是继发性甲状旁腺机能亢进症的常见病因，还与糖尿病、癌症、心血管疾病、自身免疫性疾病等有关(HolickMF.VitaminDdeficiency.[J].NewEnglandJournalofMedicine,2007,357(3):266-81.)。而维生素D过量，可能引起高血钙和高尿钙(GallagherJC,SmithLM,YalamanchiliV.IncidenceofhypercalciuriaandhypercalcemiaduringvitaminDandcalciumsupplementationinolderwomen.[J].Menopause-theJournaloftheNorthAmericanMenopauseSociety,2014,21(11):1173-80.)。因此，对于机体内维生素D水平的检测非常有必要。发现维生素D两个世纪以来，传统维生素D的检测方法主要包括酶联免疫法、放射免疫法、免疫化学发光法、竞争蛋白结合法、高效液相色谱(HPLC)法，它们主要存在以下问题：(1)免疫法和竞争蛋白结合法会受到生物样本中高亲和力结合蛋白的基质干扰，存在准确度低、特异性差的问题，同时无法区分维生素D2和维生素D3；(2)HPLC法前处理复杂、分析时间长，通量低。LC-MS/MS法具有选择性强、灵敏度高、检测时间短的特点，利用LC-MS/MS法检测血清中的25-羟基维生素D已经成为了行业金标准，将这种方法称为血清法，该方法目前是行业领域内应用最广泛的维生素D检测方法(RothHJ,Schmidt-GaykH,WeberH,etal.Accuracyandclinicalimplicationsofseven25-hydroxyvitaminDmethodscomparedwithliquidchromatography-tandemmassspectrometryasareference[J].AnnalsofClinicalBiochemistry,2008,45(Pt2):153-9.)。血清法检测维生素D的含量需要的血液样本量大为2-3mL；对于新生儿来说，一个3公斤的正常宝宝全身的含血量大概为220mL，假设抽血量为3mL，那么就意味着宝宝的失血量为1.4％，可能威胁到宝宝的正常发育成长。为了预防疾病而让宝宝处于危险中，这无疑本末倒置。除了需血量大之外，血清法运输保存都有严格的要求，采血也需要专业的医护人员，对于偏远地区的人来说检测非常不方便。因此，急需有一种新的方法来补充血清法的不足。干血斑法用血量少，适合新生儿检测，只需要在足跟或指尖采几滴血即可。这种方法不需要专业的医护人员来采血，只要按照说明书上的示范操作即可在家完成血斑的制作，而且保存持久、运输方便，因此即使地处偏远地区，也可享受到知名大医院的精准检测，只需要将样本快递到该医院即可，方便快捷。基于这些优点，干血斑法非常适宜作为血清法的补充，投入临床检测。因此，在本领域中，开发一种干血斑中维生素D的检测方法迫在眉睫。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种干血斑中维生素D含量的检测方法。为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：一方面，本专利技术提供一种干血斑中维生素D含量的前处理方法，所述方法包括以下步骤：(1)取干血斑样本，放入离心管中，加入超纯水和乙腈内标液，温浴超声，而后进行涡旋，离心，将得到的上清液转移至96孔板中，氮气吹干；(2)利用衍生剂进行衍生，采用乙醇终止衍生反应，将衍生后的溶液转移到离心管中，氮气吹干，加入40％乙腈水溶液进行复溶，即得进样液；(3)采用高效液相色谱串联质谱同时检测步骤(2)得到的进样液中25羟基维生素D3和25羟基维生素D2的含量。在本专利技术中，通过在干血斑样本中加入超纯水加强对血斑的浸润性，保证提取率，缩短提取时间，利用含内标的乙腈溶液作为沉淀剂沉淀蛋白，同时乙腈作为有机溶剂完成25羟基维生素D(25OHD)的提取。本专利技术使用干血斑法检测维生素D，用血量少，适合新生儿检测，不需要专业的医护人员来采血，样本保存持久、运输方便，非常适宜作为血清法的补充，更加准确便捷地服务大众。优选地，针对直径为3.5mm的干血斑样本，步骤(1)所述超纯水的加入量为40-60μL，例如40μL、43μL、45μL、48μL、50μL、53μL、55μL、58μL或60μL，优选50μL。优选地，步骤(1)所述乙腈内标液与超纯水的体积比为(6-4):1，例如6:1、5.8:1、5.5:1、5.3:1、5:1、4.8:1、4.5:1、4.3:1或4:1，优选5:1。优选地，步骤(1)所述乙腈内标液中含有60ng/mL的25羟基维生素D2内标(25OHD2-d3)和60ng/mL的25羟基维生素D3内标(25OHD3-d3)。优选地，步骤(1)所述温浴的温度为50-70℃，例如50℃、53℃、55℃、58℃、60℃、63℃、65℃、68℃或70℃，优选60℃。优选地，步骤(1)所述温浴的时间为30-60min，例如30min、33min、35min、38min、40min、43min、45min、48min、50min、53min、55min、58min或60min，优选30min。优选地，步骤(1)所述超声的时间为1-3min，例如1min、1.5min、2min、2.5min或3min，优选1min。优选地，步骤(1)所述涡旋的时间为20-60s，例如20s、25s、30s、35s、40s、45s、50s、55s或60s，优选30s。优选地，步骤(1)所述离心的转速为10000-15000rpm，例如10000rpm、11000rpm、12000rpm、13000rpm、14000rpm或15000本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种干血斑中维生素D含量的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)取干血斑样本，放入离心管中，加入超纯水和乙腈内标液，温浴超声，而后进行涡旋，离心，将得到的上清液转移至96孔板中，氮气吹干；(2)利用衍生剂进行衍生，采用乙醇终止衍生反应，将衍生后的溶液转移到离心管中，氮气吹干，加入40％乙腈水溶液进行复溶，即得进样液；(3)采用高效液相色谱串联质谱同时检测步骤(2)得到进样液中25羟基维生素D3和25羟基维生素D2的含量。

【技术特征摘要】
1.一种干血斑中维生素D含量的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)取干血斑样本，放入离心管中，加入超纯水和乙腈内标液，温浴超声，而后进行涡旋，离心，将得到的上清液转移至96孔板中，氮气吹干；(2)利用衍生剂进行衍生，采用乙醇终止衍生反应，将衍生后的溶液转移到离心管中，氮气吹干，加入40％乙腈水溶液进行复溶，即得进样液；(3)采用高效液相色谱串联质谱同时检测步骤(2)得到进样液中25羟基维生素D3和25羟基维生素D2的含量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，针对直径为3.5mm的干血斑样本，步骤(1)所述超纯水的加入量为40-60μL，优选50μL；优选地，步骤(1)所述乙腈内标液与超纯水的体积比为(6-4):1，优选5:1。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述乙腈内标液中含有60ng/mL的25羟基维生素D2内标和60ng/mL的25羟基维生素D3内标。4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述温浴的温度为50-70℃，优选60℃；优选地，步骤(1)所述温浴的时间为30-60min，优选30min；优选地，步骤(1)所述超声的时间为1-3min；优选地，步骤(1)所述涡旋的时间为20-60s，优选30s；优选地，步骤(1)所述离心的转速为10000-15000rpm，优选12000rpm；优选地，步骤(1)所述离心的时间为5-8min，优选5min。5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述衍生剂为4-苯基-1...

【专利技术属性】
技术研发人员：高鹏，郝维维，周高英，周雅琼，王红亮，
申请(专利权)人：北京爱普益医学检验中心有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11