牛副流感病毒3型病毒nano‑PCR检测试剂盒及其制备方法技术

牛副流感病毒3型病毒nano‑PCR检测试剂盒及其制备方法，涉及牛副流感病毒检测领域，解决了现有牛副流感病毒3型病毒检测方法存在的灵敏性低、血清学检测假阳性高、国外进口试剂昂贵的问题。该试剂盒包括MightyAmp酶、2xBuffer Mix缓冲液、金纳米颗粒溶胶、无菌双蒸水、一对特异性引物P1(5'‑GCTCTTCTCTTTTTGTCCCATTCTT‑3')、P2(5'‑AACCCCTTCCTCAATCCTGATATAC‑3')和一个牛副流感病毒3型病毒阳性对照质粒；牛副流感病毒3型病毒阳性对照质粒的序列如SEQ ID NO:2所示。本发明专利技术的试剂盒灵敏度高、简便、快速高效，成本较低。

Bovine parainfluenza virus type 3 virus nano PCR detection kit and preparation method thereof

Bovine parainfluenza virus type 3 virus nano PCR detection kit and a preparation method thereof, relates to the field of bovine parainfluenza virus detection, sensitivity to solve existing bovine parainfluenza virus type 3 virus detection method, low false positive serological detection, imported reagent expensive problem. The kit includes a MightyAmp enzyme, 2xBuffer Mix buffer solution, gold nanoparticles sol, sterile double distilled water, a pair of specific primers P1 (5'GCTCTTCTCTTTTTGTCCCATTCTT 3'), P2 (5'AACCCCTTCCTCAATCCTGATATAC 3') and a bovine parainfluenza virus type 3 virus positive control plasmid; sequence of bovine parainfluenza virus 3 virus positive control plasmid is shown as SEQ ID NO:2. The reagent box of the invention has high sensitivity, simple and convenient, fast and high efficiency and low cost.

【技术实现步骤摘要】
牛副流感病毒3型病毒nano-PCR检测试剂盒及其制备方法
本专利技术涉及牛副流感病毒检测
，具体涉及一种牛副流感病毒3型病毒nano-PCR检测试剂盒及其制备方法。
技术介绍
牛副流感病毒(Bovineparainfluenzatype-3virus，BPIV3)是能够引起牛急性呼吸道疾病综合征(Bovinerespiratorydiseasecomplex，BRDC)的重要病原体之一，是单股负链RNA病毒目、副黏病毒科、副黏病毒亚科、呼吸道病毒属的成员。1959年美国首次从牛体分离到该病毒，目前在我国各省份广泛存在，给养牛业带来巨大的经济损失。在规模化养殖厂2至6月龄犊牛感染发病率很高，死亡率低，易继发细菌感染，死亡率可达到20％以上，犊牛感染愈后再次感染症状不明显，在无临床症状的牛上也可分离到此病毒。牛副流感病是牛群的一种常发病，在牛群中较长期存在，气温骤降或长途运输等应激条件下可引起疫情暴发。目前，主要采用ELISA、中和实验、免疫组化、血凝抑制试验检测和RT-PCR、多重PCR、LAMP等方法检测牛副流感病毒。然而，现有检测牛副流感病毒3型病毒的方法普遍存在灵敏性较低、假阳性较高的缺点，并且，现有检测方法大多数采用国外进口试剂，相比国内，国外进口试剂价格昂贵，导致检测成本增加。纳米颗粒技术是当前研究的热点，其良好的应用前景目前被广泛应用于各个研究领域，纳米PCR技术是近年发展的一种新型PCR技术。2005年，我国学者李海阔首次报道金纳米粒子辅助的PCR方法，大大提高了PCR反应的特异性。因纳米PCR具有灵敏度高、特异性好、分析速度快、操作简便等优点，检测结果可靠，近年来在疫病临床诊断中得到了广泛运用。
技术实现思路
为了解决现有牛副流感病毒3型病毒检测方法存在的灵敏性低、血清学检测假阳性高、国外进口试剂昂贵的问题，本专利技术提供一种牛副流感病毒3型病毒nano-PCR检测试剂盒及其制备方法。本专利技术为解决技术问题所采用的技术方案如下：本专利技术的牛副流感病毒3型病毒nano-PCR检测试剂盒，该试剂盒包括：MightyAmp酶、2xBufferMix缓冲液、金纳米颗粒溶胶、无菌双蒸水、一对特异性引物和一个牛副流感病毒3型病毒阳性对照质粒；所述一对特异性引物分别为：鉴定牛副流感病毒3型病毒的引物P1和P2：P1：5'-GCTCTTCTCTTTTTGTCCCATTCTT-3'，P2：5'-AACCCCTTCCTCAATCCTGATATAC-3'；所述牛副流感病毒3型病毒阳性对照质粒为含有422个碱基的核苷酸片段构成的pMD18-T重组质粒，其序列如序列表中的SEQIDNO:2所示；所述含有422个碱基的核苷酸片段构成的pMD18-T重组质粒能够在大肠杆菌DH5α感受态细胞中增殖。作为优选的实施方式，所述含有422个碱基的核苷酸片段的序列如序列表中的SEQIDNO:1所示。作为优选的实施方式，该试剂盒还包括阴性对照，所述阴性对照为蒸馏水。本专利技术还提供了上述牛副流感病毒3型病毒nano-PCR检测试剂盒的制备方法，该方法包括以下步骤：(1)配制nano-PCR反应液所述反应液包括：MightyAmp酶、2xBufferMix缓冲液、金纳米颗粒溶胶、无菌双蒸水和一对特异性引物；所述一对特异性引物分别为：鉴定牛副流感病毒3型病毒的引物P1和P2：P1：5'-GCTCTTCTCTTTTTGTCCCATTCTT-3'，P2：5'-AACCCCTTCCTCAATCCTGATATAC-3'；(2)建立牛副流感病毒3型病毒阳性对照质粒所述牛副流感病毒3型病毒阳性对照质粒为含有422个碱基的核苷酸片段构成的pMD18-T重组质粒，其序列如序列表中的SEQIDNO:2所示；所述含有422个碱基的核苷酸片段构成的pMD18-T重组质粒能够在大肠杆菌DH5α感受态细胞中增殖；(3)阴性对照：所述阴性对照为蒸馏水。作为优选的实施方式，所述牛副流感病毒3型病毒阳性对照质粒通过以下方法制备：以牛副流感病毒3型病毒的NP基因为模板，以P1和P2为引物进行PCR扩增，得到长度为422bp的扩增产物，将扩增产物回收并纯化后克隆至pMD18-T载体，得到牛副流感病毒3型病毒阳性对照质粒，其序列如序列表中的SEQIDNO:2所示。作为优选的实施方式，以P1和P2为引物进行PCR扩增的反应条件为：98℃2min；98℃10s，57℃5s，68℃1min，35个循环；68℃总延伸10min。作为优选的实施方式，所述金纳米颗粒溶胶的直径为20nm，浓度为0.5μg/μL。本专利技术的有益效果是：1、本专利技术根据牛副流感病毒3型病毒基因组的保守基因NP序列设计一对特异性引物，通过组装得到检测牛副流感病毒3型病毒nano-PCR检测试剂盒，与现有技术相比，本专利技术的nano-PCR检测试剂盒可以在低核酸含量、退火温度温差范围10℃内，退火时间5秒以内检测被检测样品中是否含有牛副流感病毒3型病毒(BPIV3)核酸，具有较高的特异性和敏感性，敏感性是常规RT-PCR的10倍，比常规RT-PCR技术高效灵敏特异的特点，可以对牛群中感染和发病动物进行准确检测。2、本专利技术的牛副流感病毒3型病毒nano-PCR检测试剂盒可以对细胞培养物、血液、组织培养物、鼻拭子及粪拭子等多种样品的牛副流感病毒3型病毒(BPIV3)进行快速检测，样品适用范围广，试剂盒提供的试剂无感染性、无生物安全隐患成分，使用安全性高。3、本专利技术的牛副流感病毒3型病毒nano-PCR检测试剂盒可在收到样品7小时内给出进行定性检测结果，省时省力，是一种检测牛副流感病毒3型病毒早期发病和预后筛查的有效工具。4、相比采用国外进口试剂，本专利技术采用的试剂均为实验室自行保存的，试剂成本大大降低，从而降低整个检测的成本。5、本专利技术针对牛副流感病毒3型病毒(BPIV3)利用纳米金与PCR分子检测技术，建立BRSV高灵敏度、简便、快速高效的纳米PCR检测试剂盒，可以用于实现对BPIV3的快速诊断，对疫病早期发现和控制具有重要意义。附图说明图1为本专利技术的牛副流感病毒3型病毒nano-PCR检测试剂盒的特异性检测电泳图。图中：M为DL2000DNAMarker，1为BPIV3引物nano-PCR结果，2为IBRV阳性对照模板，3为BVDV阳性对照模板，4为BRSV阳性对照模板，5为阴性对照。图2为本专利技术的牛副流感病毒3型病毒nano-PCR检测试剂盒的敏感性检测电泳图。图中：BPIV3阳性对照重组质粒的检测浓度为4.16×108拷贝/μL～4.16×101拷贝/μL。图3为本专利技术的牛副流感病毒3型病毒nano-PCR检测试剂盒的敏感性普通RT-PCR对比检测电泳图。图中：BPIV3阳性对照重组质粒的检测浓度为4.16×108拷贝/μL～4.16×101拷贝/μL。图4为本专利技术的牛副流感病毒3型病毒nano-PCR检测试剂盒的临床BPIV3病毒样品检测电泳图。图中：M为DL2000DNAMarker，5、7、10、11均为BPIV3病毒的阳性检测结果，2、3、4、6、8、9均为BPIV3病毒的阴性检测结果，1为阴性对照。图5为本专利技术的牛副流感病毒3型病毒nano-PCR检测试剂盒的临床BPIV3病毒样品普通RT-PCR对本文档来自技高网...

【技术保护点】
牛副流感病毒3型病毒nano‑PCR检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：MightyAmp酶、2xBufferMix缓冲液、金纳米颗粒溶胶、无菌双蒸水、一对特异性引物和一个牛副流感病毒3型病毒阳性对照质粒；所述一对特异性引物分别为：鉴定牛副流感病毒3型病毒的引物P1和P2：P1：5'‑GCTCTTCTCTTTTTGTCCCATTCTT‑3'，P2：5'‑AACCCCTTCCTCAATCCTGATATAC‑3'；所述牛副流感病毒3型病毒阳性对照质粒为含有422个碱基的核苷酸片段构成的pMD18‑T重组质粒，其序列如序列表中的SEQ ID NO:2所示；所述含有422个碱基的核苷酸片段构成的pMD18‑T重组质粒能够在大肠杆菌DH5α感受态细胞中增殖。

【技术特征摘要】
1.牛副流感病毒3型病毒nano-PCR检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：MightyAmp酶、2xBufferMix缓冲液、金纳米颗粒溶胶、无菌双蒸水、一对特异性引物和一个牛副流感病毒3型病毒阳性对照质粒；所述一对特异性引物分别为：鉴定牛副流感病毒3型病毒的引物P1和P2：P1：5'-GCTCTTCTCTTTTTGTCCCATTCTT-3'，P2：5'-AACCCCTTCCTCAATCCTGATATAC-3'；所述牛副流感病毒3型病毒阳性对照质粒为含有422个碱基的核苷酸片段构成的pMD18-T重组质粒，其序列如序列表中的SEQIDNO:2所示；所述含有422个碱基的核苷酸片段构成的pMD18-T重组质粒能够在大肠杆菌DH5α感受态细胞中增殖。2.根据权利要求1所述的牛副流感病毒3型病毒nano-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述含有422个碱基的核苷酸片段的序列如序列表中的SEQIDNO:1所示。3.根据权利要求1所述的牛副流感病毒3型病毒nano-PCR检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括阴性对照，所述阴性对照为蒸馏水。4.制备权利要求1至3中任意一项所述的牛副流感病毒3型病毒nano-PCR检测试剂盒的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)配制nano-PCR反应液所述反应液包括：MightyAmp酶、2xBufferMix缓冲液、金纳米颗粒溶胶、无菌双蒸水和一对特异性引物；所述一对特异性引物分别为：鉴定牛副流感病毒3...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭利，王超，任静强，孙娜，朱红伟，易立，程世鹏，
申请(专利权)人：中国农业科学院特产研究所，
类型：发明
国别省市：吉林,22