一种偶数DNA分子量标准及其制备方法技术

利用基因工程和基因合成的方法得到两种重组载体p2186和p1000。分别采用核酸发酵制备p2186 DNA载体，然后进行EcoRI完全酶切，进而获得摩尔数相当的2kb、1kb、800bp、600bp的DNA片混合物‑Mix1。以质粒p1000为PCR模板，以特异引物进行扩增，获得1000bp的PCR产物，用EcoRI进行部分（不完全）酶切，可获得5种 DNA片段混合物‑Mix2。Mix1和Mix2经过适当调配，可以组成条带分布均匀的200bp ladder DNA分子量标准,其组成包括200bp、400bp、600bp、800bp、1000bp和2000bp，共6种双链DNA片段。本发明专利技术公开的两种200bp ladder制备用核酸载体p2186和p1000及其制备200bp ladder DNA分子量标准的方法，具有较大的技术及成本优势，不但效率高，省时省力，同时所得到的DNA分子量标准片段质量明显优于单一的载体酶切或PCR扩增来源的同类DNA 分子量标准。

An even number DNA molecular weight standard and preparation method thereof

Two recombinant vectors, p2186 and P1000, were obtained by gene engineering and gene synthesis. Using nucleic acid preparation by fermentation p2186 DNA vector, then EcoRI complete digestion, and then get the number of moles of 2KB, 1KB, 800bp a, 600bp DNA Mix1 mixture. With the plasmid P1000 PCR template, with specific primers were amplified PCR products of 1000bp and EcoRI with partial (incomplete) enzyme, can obtain 5 kinds of DNA fragment mixture Mix2. Mix1 and Mix2 after proper deployment, 200bp can ladder DNA molecular weight standards strip evenly, which is composed of 200bp, 400bp, 600bp, 800bp, 1000bp and 2000bp, a total of 6 kinds of double stranded DNA fragments. Methods two 200bp ladder for preparation of nucleic acid vectors p2186 and P1000 and preparation of 200bp ladder DNA molecular weight standard disclosed by the invention has the technical and cost advantage is larger, not only high efficiency, time saving, similar DNA molecular weight standard amplification source and the obtained DNA molecular weight standard fragment quality significantly is better than a single enzyme or PCR.

【技术实现步骤摘要】
一种偶数DNA分子量标准及其制备方法
本专利技术涉及分子生物学和基因工程研究与应用领域。具体地说，涉及一种200bpladderDNA分子量标准制备用载体组合及其在制备200bpladderDNA分子量标准中的应用。
技术介绍
DNA分子量标准是指一组分子量已知的DNA分子的混合物，电泳后按照其分子量的大小和迁移率的不同，在电泳凝胶（琼脂糖凝胶或PAGE凝胶）上形成一个DNA片段分布的梯度(ladder)，用以指示电泳过程中未知DNA样品的分子量。目前，各种规格的DNA分子量标准多由专业的生物技术公司专门生产。国内市场上的DNA分子量标准从最初的以进口产品为主、到目前以国产产品为主和许多自制品的出现，制备和生产DNA分子量标准的方法为越来越多的人所掌握。DNA分子量标准的生产主要涉及DNA样本的酶切消化产生较大的DNA分子和PCR扩增制备较小的DNA分子；其中限制性内切酶酶切的DNA分子的来源又可以分为天然的基因组DNA和人工构建的质粒载体；PCR扩增又可分为单片段的扩增和多片段的扩增。1.通过限制性核酸内切酶酶切制备DNA分子量标准利用DNA分子中存在的限制性内切酶酶切位点（天然的或人为加入的），采用合适的内切酶对其进行消化，从而形成一组分子量各异的DNA片段，用来作为DNA分子量标准。按照被消化DNA的来源可以分为两种：天然来源的特种DNA（如基因组）和人工构建的质粒DNA。天然来源的基因组DNA的限制性内切酶酶切是通过分离某种来源的基因组DNA分子，然后用一种或几种限制性内切酶进行消化，从而产生一系列的DNA片段组合，目前最常见的此类DNA分子是Lamda噬菌体的基因组DNA（λDNA），由其产生的DNA分子量标准有λDNA/HindIII，λDNA/EcoRI+HindIII等，也可以是某种具有多个常见酶切位点质粒，如pBR322DNA/AluImarker和pBR322DNA/BsuRI(HaeIII)marker，但是所用的内切酶都是不常用的，因而成本较高。人工构建载体(质粒)的限制性内切酶酶切是通过一次性把所需要的各种DNA片段克隆到高拷贝数的载体上，转入大肠杆菌，通过发酵培养和质粒DNA的分离纯化，经过适当的酶切即可以获得大量的目标DNA片段。这种方法的优势在于通过大肠杆菌的发酵扩增质粒获得目的DNA片段，其制备规模很容易放大（50升的发酵体系很容易建立，而PCR扩增一般只能在小于500微升的体系内进行），获得的DNA片段条带在凝胶上条带锐利，过程重复性高。不存在PCR扩增再现性不好的缺点。而且由于质粒是一种遗传单位具有生命的基本特性即无限繁殖（扩增），所以这种质粒一旦构建好，即可以无限应用，不存在再生的问题。因而具有很大的应用空间。2.通过PCR扩增制备DNA分子量标准由于PCR（PolymeraseChainReaction）技术强大的DNA片段的扩增能力，同时由于目前TaqDNA聚合酶工程菌株的广为流传，目前利用PCR方法生产DNA分子量标准不存在技术问题，成本主要是引物合成和dNTP的购置，其他PCR试剂如TaqDNA聚合酶，模板DNA，反应Buffer等均可自制。由于生产效率低，浓度强度高，因而限制了其大规模的制备和应用。在DNA分子量标准制备研究方面，我国科研工作者进行了较为系统的研究，如叶春江等人构建了多个具有实际应用价值的DNA重组载体，通过酶切可以产生多种具有核酸分子量参考意义的DNA片段组合(YeChunjiang.Electrophoresis,2010,31:2929–2935;WuJianbingMolBiolRep.2011,38(4):2729–2731;ZheChenMol.Biotechnol.2009,42(1):128-133;HuangDongyi.PlantMolecularBiologyReporter200826(4):316-323;张颖.中国生物工程杂志.2009,29(8):119-123)。长期以来，分子生物学试剂与基因工程研究领域，特别是核酸电泳领域，对于200bpDNAladder的制备缺少一种简单高效的方法。普遍存在技术水平低，简单重复工作为主的DNAmarker制备方法。从而使得目前该种类型的DNAmarker价格居高不下，既造成了巨大的人力、原料浪费，同时对广大科研工作者造成了一定的影响。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有200bpladderDNA分子量标准制备技术的不足，提供一种高效、低成本的制备方法。经过长期的研究和探索，本专利技术恰恰满足了本领域上述技术缺陷，实现了DNA分子量标准的高效率、低成本制造。通过构建两种DNA片段载体及其组合运用，实现了在200bpladderDNA分子量标准制备过程中发挥核酸发酵和PCR扩增两种方法各自优势的整合。其目的在于：实现一种技术含量高、成本低、效率高的200bpDNAladder制备方法，提高该种DNA分子量标准质量的同时，有效的降低了制备成本，提高了生产效率。本专利技术进一步的目的在于：公开一种用于200bpDNAladder制备的重组载体及在制备200bpDNAladder中的组合运用。为了实现上述目的，本专利技术采用了如下的技术方案：1.重组载体p2186的构建：利用生物信息学软件DNAMAN(LynnonBiosoft)分析NCBI数据库中拟南芥基因组DNA染色体序列数据(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/4)，获得了一组内源性的EcoRI位点。利用自主开发的生物信息学软件GASAP（申请人课题组自有软件）分析内源性的EcoRI位点分部模式A，获得了一条特征序列，其特点为GAATTC－－－（1000bp）－－－GAATTC，命名为S(EcoRI1000EcoRI)序列，即两个相邻的EcoRI位点之间有1000bp的距离。然后再用生物信息学软件DNAMAN定位S(EcoRI1000EcoRI)上游800bp、下游600bp区域，选择其中不带有PstI、SphI和EcoRI位点的基因组区域为PCR扩增区，分别设计上游和下游引物靶序列，以使得PCR扩增获得E800-(EcoRI1000EcoRI)-600E的DNA产物，即2400（800+1000+600）bp的产物。将上述PCR产物克隆（TA克隆）进入突变过的T载体（载体大小为2kb）,获得重组载体p2186,该载体经过EcoRI酶切，可以释放其中的2kb、1kb、800bp、600bp的DNA片段，其中由于各片段摩尔数相同，因而其质量数不同，其质量比例为：2kb:1kb:800bp:600bp=2:1:0.8:0.6。2.重组载体p1000的构建：人工设计了5组重复的200bp片段(片段序列无特别指定)，每两个相邻的200bp片段之间均有EcoRI位点序列，且该1000bp片段的首尾（5′和3′末端）均具有EcoRI位点，同时5′和3′末端除了EcoRI位点之外，其序列组成在1000bp片段序列中具有唯一性,作为引物结合位点，以确保PCR扩增产物的唯一性。该序列被亚克隆到高拷贝质粒pT2K载体中，所得质粒命名为p1000。由于重组质粒载体结构特征，p2186经大肠杆菌发酵富集后，通本文档来自技高网...

【技术保护点】
制备本专利技术中200bp ladder 的技术体系由两种人工构建和全基因合成的核酸重组载体p2186和 p1000构成。

【技术特征摘要】
1.制备本发明中200bpladder的技术体系由两种人工构建和全基因合成的核酸重组载体p2186和p1000构成。2.p2186适用于核酸发酵和限制性内切酶完全酶切。3.p1000适用于作PCR模板，扩增获得具有复合结构的PCR产物，获得的扩增产物再进行限制性内切酶消化。4.根据权利要求1所述的重组载体p2186，其特征在于，其中包含1个拷贝的2000bp、1000bp、800bp、600bp4种DNA片段，经过酶切，从而产生含有4种DNA片段的混合物-Mix1。5.根据权利要求1所述，重组载体p1000，其特征在于其中含有5个重复的200bpDNA片段，每两个重复单位之间均存在EcoRI酶切位点，经过PCR扩增获得的1000bpDNA片段经过酶切，可以产生200bp、400bp、600bp、800bp和1000bp的5种DNA片段混合物-M...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶春江，王凯，王元秀，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东,37