一种生产阿魏酸的固定化基因工程酶的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种生产阿魏酸的固定化基因工程酶的制备方法，将海藻酸钠于50～85℃水中搅拌溶解，使其质量分数为0.5％～4.5％，冷却至室温后加入100μg重组化川芎咖啡酸‑3‑O‑甲基转移酶，在4℃层析冷柜中用磁力搅拌器搅拌混合均匀，用5mL注射器从10cm左右高度滴入2.5～40g/L CaCl

Method for preparing immobilized gene engineering enzyme for producing ferulic acid

The invention discloses a preparation method of immobilized enzyme gene engineering for producing ferulic acid, sodium alginate in 50 ~ 85 DEG C water stirring and dissolving, the mass fraction of 0.5% ~ 4.5%, cooled to room temperature after adding 100 g of recombinant O 3 Chuanxiong caffeic acid methyltransferase, in 4 C in chromatography freezer with magnetic stirrer stirring the mixture with 5mL syringe from about 10cm height drops from 2.5 to 40g/L CaCl

【技术实现步骤摘要】
一种生产阿魏酸的固定化基因工程酶的制备方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种用于生产阿魏酸的固定化基因工程酶的制备方法。
技术介绍
阿魏酸，化学名4-羟基-3-甲氧基肉桂酸，是咖啡酸的衍生物。目前，已在多种蔬菜、水果及饮料(咖啡、啤酒)中发现。阿魏酸具有抑制血小板聚集、解除血管平滑肌痉挛和提高膜稳定性以及抗炎、抗氧化、镇痛、调节免疫功能等药理作用，广泛应用于医药、农药、保健品、化妆品原料和食品添加剂等方面。中国专利申请号：201510075678.0公开了一种川芎LCCOMT重组酶转化合成阿魏酸的方法，然而现有的技术使用游离酶，游离酶与产物难以直接分离，导致酶无法反复利用，具有成本高、不能用于持续化生产等缺点。
技术实现思路
鉴于现有技术的以上不足，本专利技术的目的是提出一种用于生产阿魏酸的固定化基因工程酶的制备方法，固定化酶具有不溶于水，易与产物分离，稳定性好，可用于持续化生产的优点。本专利技术的一种用于生产阿魏酸的固定化基因工程酶的制备方法，主要步骤如下：将海藻酸钠于50～85℃水中搅拌溶解，使其质量分数为0.5％～4.5％，冷却至室温后加入100μg重组化川芎咖啡酸-3-O-甲基转移酶，在4℃层析冷柜中用磁力搅拌器搅拌混合均匀，用5mL注射器从10cm左右高度滴入2.5～40g/LCaCl2溶液中，4℃固定化0.5～10h后，用蒸馏水洗涤2～3次并抽滤掉表面水分，放于4℃冰箱保存。本专利技术的一种用于生产阿魏酸的固定化基因工程酶的制备方法中，海藻酸钠溶液与酶质量之比为2000:1～35000:1。本专利技术的一种用于生产阿魏酸的固定化基因工程酶的制备方法中，海藻酸钠质量分数为2.0％。本专利技术的一种用于生产阿魏酸的固定化基因工程酶的制备方法中，CaCl2浓度为2.5g/L。本专利技术的一种用于生产阿魏酸的固定化基因工程酶的制备方法中，固定化时间为1h。本专利技术的一种用于生产阿魏酸的固定化基因工程酶的制备方法中，海藻酸钠溶液与酶质量之比为35000:1。本专利技术的一种用于生产阿魏酸的固定化基因工程酶的制备方法中，海藻酸钠质量分数为2.0％、CaCl2浓度为2.5g/L、固定化时间为1h、海藻酸钠溶液与酶质量比为35000:1。与目前技术相比，本专利技术主要具有以下有益效果：本专利技术固定化酶具有不溶于水，易与产物分离，稳定性好，可用于持续化生产的优点。与游离酶相比，固定化酶相对酶活力为75.43％，连续使用12次，酶活力仍保留34.10％(与固定化酶第一次反应酶活力相比)。这达到了使重组化川芎咖啡酸-3-O-甲基转移酶的一般稳定性增加、易从反应系统中分离且能反复多次使用的目的，并为工业化生产阿魏酸打下良好的基础，同时也降低了酶的使用成本。本专利技术中所用原料海藻酸钠广泛应用于食品行业和医药领域，交联剂CaCl2也在食品制造、建筑材料、医学和生物学等多个方面均有重要的应用价值。所用原料均为绿色、环保、安全无毒材料，对环境无二次污染，且制备工艺简单易行，成本较低，节能环保，具有很好的社会效益和环境效益。以海藻酸钠为原料，CaCl2为交联剂，可实现对重组化川芎咖啡酸-3-O-甲基转移酶重组酶的固定化，达到使重组酶的一般稳定性增加、易从反应系统中分离且能反复多次使用的目的，并为工业化生产阿魏酸打下良好的基础，同时也降低了酶的使用成本。附图说明图1海藻酸钠质量分数的影响。图2CaCl2浓度的影响。图3固定化时间的影响。图4海藻酸钠溶液与酶质量之比的影响。图5固定化酶操作稳定性。图6固定化酶照片。图7固定化酶活性检测HPLC图。具体实施方式下面通过具体的实例对本专利技术做进一步详细的描述。专利技术技术方案不局限于以下所列举的具体实施方式，还包括各具体实施方式的任意组合。实施例1称取1.05g海藻酸钠于250mL烧杯中，用脱氧去离子水于70℃水浴条件下搅拌溶解，得无色透明溶液，冷却至室温后加脱氧去离子水至52.5g，再加入1500μg重组化川芎咖啡酸-3-O-甲基转移酶,在4℃层析冷柜中用磁力搅拌器搅拌混合均匀，用分析天平称量3.5g混合物于5mL注射器中，从10cm左右高度滴入浓度为2.5g/L的CaCl2溶液，4℃固定化1h后，用蒸馏水洗涤2次并抽滤掉表面水分，放于4℃冰箱保存备用。实施例2称取1.05g海藻酸钠于250mL烧杯中，用脱氧去离子水于70℃水浴条件下搅拌溶解，得无色透明溶液，冷却至室温后加脱氧去离子水至52.5g，再加入1500μg重组化川芎咖啡酸-3-O-甲基转移酶,在4℃层析冷柜中用磁力搅拌器搅拌混合均匀，用分析天平称量3.5g混合物于5mL注射器中，从10cm左右高度滴入浓度为2.5～40g/L的CaCl2溶液，4℃固定化1h后，用蒸馏水洗涤2次并抽滤掉表面水分，放于4℃冰箱保存备用。实施例3称取1.05g海藻酸钠于250mL烧杯中，用脱氧去离子水于70℃水浴条件下搅拌溶解，得无色透明溶液，冷却至室温后加脱氧去离子水至52.5g，再加入1500μg重组化川芎咖啡酸-3-O-甲基转移酶,在4℃层析冷柜中用磁力搅拌器搅拌混合均匀，用分析天平称量3.5g混合物于5mL注射器中，从10cm左右高度滴入浓度为2.5g/L的CaCl2溶液，4℃固定化0.5～10h后，用蒸馏水洗涤2次并抽滤掉表面水分，放于4℃冰箱保存备用。实施例4称取0.525g海藻酸钠于250mL烧杯中，用脱氧去离子水于70℃水浴条件下搅拌溶解，得无色透明溶液，冷却至室温后加脱氧去离子水至52.5g，再加入1500μg重组化川芎咖啡酸-3-O-甲基转移酶,在4℃层析冷柜中用磁力搅拌器搅拌混合均匀，用分析天平称量3.5g混合物于5mL注射器中，从10cm左右高度滴入浓度为2.5g/L的CaCl2溶液，4℃固定化2h后，用蒸馏水洗涤2次并抽滤掉表面水分，放于4℃冰箱保存备用。实施例5称取0.9g海藻酸钠于250mL烧杯中，用脱氧去离子水于70℃水浴条件下搅拌溶解，得无色透明溶液，冷却至室温后加脱氧去离子水至45.0g，再加入1500μg重组化川芎咖啡酸-3-O-甲基转移酶,在4℃层析冷柜中用磁力搅拌器搅拌混合均匀，用分析天平称量3.0g混合物于5mL注射器中，从10cm左右高度滴入浓度为2.5g/L的CaCl2溶液，4℃固定化2h后，用蒸馏水洗涤2次并抽滤掉表面水分，放于4℃冰箱保存备用。实施例6固定化川芎咖啡酸-3-O-甲基转移酶活性鉴定反应体系为：200mMTris-HCl缓冲液(pH7.5)，500μM咖啡酸，1mMS-腺苷甲硫氨酸(SAM)，1.5mMMgCl2，1mM二硫苏糖醇(DTT)，相应固定化川芎咖啡酸-3-O-甲基转移酶，总体积10mL，37℃静止反应2h，加1mL浓HCl终止反应。用5mL乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，旋转蒸发仪浓缩蒸干，用甲醇：甲酸(95:5)溶解并定容至5mL，高效液相色谱法检测阿魏酸含量。高效液相色谱条件为：上样量10μL，流动相：0.1％的磷酸-甲醇(66:34)，流速：1mL/min，柱温30℃，检测波长为323nm。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产阿魏酸的固定化基因工程酶的制备方法，主要步骤如下：将海藻酸钠于50～85℃水中搅拌溶解，使其质量分数为0.5％～4.5％，冷却至室温后加入100μg重组化川芎咖啡酸‑3‑O‑甲基转移酶，在4℃层析冷柜中用磁力搅拌器搅拌混合均匀，用5mL注射器从10cm左右高度滴入2.5～40g/L CaCl

【技术特征摘要】
1.一种生产阿魏酸的固定化基因工程酶的制备方法，主要步骤如下：将海藻酸钠于50～85℃水中搅拌溶解，使其质量分数为0.5％～4.5％，冷却至室温后加入100μg重组化川芎咖啡酸-3-O-甲基转移酶，在4℃层析冷柜中用磁力搅拌器搅拌混合均匀，用5mL注射器从10cm左右高度滴入2.5～40g/LCaCl2溶液中，4℃固定化0.5～10h后，用蒸馏水洗涤2～3次并抽滤掉表面水分，放于4℃冰箱保存。2.根据权利要求1所述的一种生产阿魏酸的固定化基因工程酶的制备方法，其特征在于，所述的海藻酸钠溶液与酶质量之比为2000:1～35000:1。3.根据权利要求1所述的一种生产阿魏酸的固定化基因工程酶的制...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖海，周嘉裕，朱建全，向缅，李洋洋，俞继华，邓银，张娴，吴微波，
申请(专利权)人：西南交通大学，
类型：发明
国别省市：四川,51