可溶性透明质酸酶的大规模生产制造技术

本发明专利技术提供用于制备大规模的可溶性透明质酸酶制备品的方法。该方法利用含有多个活性拷贝的编码可溶性透明质酸酶的核酸的细胞，以及利用多种加料和温度的变化，由此经编码的可溶性透明质酸酶被分泌到细胞培养基中。

Mass production of soluble hyaluronidase

The invention provides a method for preparing soluble hyaluronidase spare mass. The method uses multiple copies containing active encoding soluble hyaluronidase nucleic acid cell, and the use of multiple feeding and temperature changes, thus the soluble hyaluronidase encoding is secreted into the cell culture medium.

【技术实现步骤摘要】
可溶性透明质酸酶的大规模生产本申请是申请日为2009年3月6日的第200980107850.9号专利技术名称为“可溶性透明质酸酶的大规模生产”的中国专利申请的分案申请。相关申请本申请要求美国临时申请No.61/068,622的优先权，该临时申请的申请人为DavidBaker和LouisBookbinder，专利技术名称为“可溶性透明质酸酶的大规模生产”，于2008年3月6日提交。本申请涉及美国专利申请No.11/238,171，后者的申请人为LouisBookbinder,AnirbanKundu,GregoryI.Frost,MichaelF.Haller,GilbertA.Keller和TylerM.Dylan，专利技术名称为SOLUBLEGLYCOSAMINOGLYCANSANDMETHODSOFPREPARINGANDUSINGSOLUBLEGLYCOSAMINOGLYCANS，于2005年9月27日提交并作为美国专利公开文本No.20060104968公开，其是申请人为LouisBookbinder,AnirbanKundu,GregoryI.Frost,MichaelF.Haller,GilbertA.Keller和TylerM.Dylan的美国专利申请No.11/065,716的部分继续申请，该美国专利申请No.11/065,716的专利技术名称是SOLUBLEGLYCOSAMINOGLYCANSANDMETHODSOFPREPARINGANDUSINGSOLUBLEGLYCOSAMINOGLYCANS，于2005年2月23日提交并作为美国专利公开文本No.20050260186公开，其是申请人为LouisBookbinder,AnirbanKundu和GregoryI.Frost的美国专利申请No.10/795,095的部分继续申请,该美国专利申请No.10/795,095的专利技术名称是SOLUBLEHYALURONIDASEGLYCOPROTEIN(SHASEGP),PROCESSFORPREPARINGTHESAME,USESANDPHARMACEUTICALCOMPOSITIONSCOMPRISINGTHEREOF，于2004年3月5日提交并作为美国专利公开No.20040268425公开。通过引用将每个上述的专利申请的全部内容并入本文。专利
本专利技术提供用于大规模生产重组人蛋白的方法。
技术介绍
透明质酸酶是降解透明质酸(也知为乙酰透明质酸或透明质酸盐)的酶家族，透明质酸是胞外基质的必需组分以及间质屏障的主要成分。通过催化透明质酸的水解,透明质酸酶降低透明质酸的黏度,由此提高组织的通透性。这样,透明质酸酶被用作例如与其它药剂、药物和蛋白联用的扩散或分散剂以增强它们的分散和传递。透明质酸酶也具有其它治疗和美容用途。由于对透明质酸酶用于治疗和美容用途的使用日益增加,因而需要大规模量的纯化的透明质酸酶。因此，在本专利技术的目标中，提供用于透明质酸酶的生产和纯化的方法是一个目标。
技术实现思路
本专利技术所提供的是用于可溶性透明质酸酶的生产和纯化的方法。特别是,本专利技术提供了用于可溶性rHuPH20的生产和纯化的方法。本专利技术也提供了含有可溶性rHuPH20的细胞培养基以及所收获的细胞培养液。本专利技术所提供的方法可用于生产和纯化任意量的可溶性透明质酸酶，如rHuPH20。例如，本文所描述的方法和步骤是可修改的，用于规模放大或规模缩小，这对于本领域技术人员是明显的。本专利技术所提供的方法可用于生产和纯化大规模量的可溶性rHuPH20。本专利技术所提供的用于生产可溶性rHuPH20的方法可包括：a)用编码可溶性rHuPH20的细胞的接种物对生物反应器中的细胞培养基进行接种以产生细胞培养物,其中细胞含有150到300个拷贝的编码可溶性rHuPH20的核酸,所述生物反应器含有至少100升的细胞培养物并且每100升细胞培养物接种大约1010–1011个细胞以及细胞在设定的温度进行培养；b)用含有足以提高细胞生长及峰值细胞密度并提高可溶性rHuPH20的合成的葡萄糖、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、人胰岛素和酵母提取物的第一加料培养基(加料培养基)给所述细胞加料,其中将所述加料培养基以细胞培养物体积4％的体积加入到该培养物中；c)用含有足以提高可溶性rHuPH20合成及诱导细胞周期停滞的量的葡萄糖、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、酵母提取物和丁酸钠的第二加料培养基给所述细胞加料,其中L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的量相对于第二个步骤中L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的量是降低的,且酵母提取物的量相对于步骤b)中的酵母提取物的量是升高的,并且将所述加料培养基以细胞培养物体积4％的体积加入到该培养物中，以及温度相对于步骤a)中的温度降低至足以提高细胞周期停滞、提高细胞生存力和使可溶性透明质酸酶稳定的温度；d)用含有足以提高可溶性rHuPH20合成及提高细胞周期停滞的量的葡萄糖、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、酵母提取物和丁酸钠的第三加料培养基给所述细胞加料,其中将所述加料培养基以细胞培养物体积4％的体积加入到该培养物中,L-丙氨酰-L-谷氨酰胺和葡萄糖的量相对于步骤c)中L-丙氨酰-L-谷氨酰胺和葡萄糖的量是降低的,而酵母提取物和丁酸钠的量相对于步骤c)中酵母提取物和丁酸钠的量是增加的,并且温度相对于步骤c)中的温度降低至足以提高细胞周期停滞、提高细胞生存力和使可溶性透明质酸酶稳定的温度；e)用含有足以提高可溶性rHuPH20合成及提高细胞周期停滞的量的葡萄糖、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、酵母提取物和丁酸钠的第四加料培养基给所述细胞加料,其中L-丙氨酰-L-谷氨酰胺和葡萄糖的量相对于步骤d)中L-丙氨酰-L-谷氨酰胺和葡萄糖的量是降低的,丁酸钠的量相对于步骤d)中丁酸钠的量是降低的,温度相对于步骤d)中的温度降低至足以提高细胞周期停滞、提高细胞生存力和使可溶性透明质酸酶稳定的温度并且将所述加料培养基以细胞培养物体积4％的体积加入到该培养物中；f)培养所述细胞直至生存力跌落到低于至少或大约50％；g)获得该收获细胞培养液；以及h)将所述可溶性rHuPH20从所述收获细胞培养液中纯化。可将所述收获细胞培养液在纯化前过滤。在某些实例中,步骤a)中的温度是37℃,步骤c)中的温度是36.5℃,步骤d)中的温度是36℃以及步骤d)中的温度是35.5℃。所述可溶性rHuPH20的纯化可由柱层析实现,如串珠状交联琼脂糖柱层析、串珠状交联苯基取代琼脂糖柱层析、氨基苯硼酸盐柱层析和羟基磷灰石柱层析。在一个实例中,生产可溶性rHuPH20的方法包括步骤：a)用编码可溶性rHuPH20的细胞的接种物对生物反应器中的细胞培养基进行接种以产生细胞培养物,其中该细胞含有150到300个拷贝的编码可溶性rHuPH20的核酸,所述生物反应器含有至少100升的细胞培养物,该接种细胞的密度为或者约为4×105细胞/mL并且将该细胞在37℃培养；b)用含有或大约含有33g/L葡萄糖、32mML-丙氨酰-L-谷氨酰胺、16.6g/L酵母提取物和33mg/L胰岛素的第一加料培养基给该细胞加料,其中将所述加料培养基以细胞培养物体积4％的体积加入到该培养物中；c)用含有或大约含有33g/L葡萄糖、16mML-丙氨酰本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种收获的细胞培养液，包含所收获的具有大于5000单位/mL酶活性的可溶性重组人PH20，其中所收获的细胞培养液是指从细胞、细胞碎片和集合物分离的液体，其未进行进一步纯化或浓缩。

【技术特征摘要】
2008.03.06 US 61/068,6221.一种收获的细胞培养液，包含所收获的具有大于5000单位/mL酶活性的可溶性重组人PH20，其中所收获的细胞培养液是指从细胞、细胞碎片和集合物分离的液体，其未进行进一步纯化或浓缩。2.权利要求1的收获的细胞培养液，其中所述酶活性是10,000单位/mL、12,000单位/mL、14,000单位/mL、16,000单位/mL、18,000单位/mL、20,000单位/mL、22,000单位/mL或24,000单位/mL。3.权利要求1或2的收获的细胞培养液，其中编码可溶性人PH20的细胞是DG44CHO细胞。4.权利要求1或2的收获的细胞培养液，其中所述可溶性重组人PH20的氨基酸序列为SEQIDNOs:4-9之一的序列或具有与SEQIDNOs:4-9之一的序列98％、99％或更高序列相同性，其中所述序列相同性根据全部序列的长度确定。5.权利要求1或2的收获的细胞培养液，其中所述可溶性重组人PH20的氨基酸序列为SEQIDNOs:4-9之一的序列。6.权利要求1或2的收获的细胞培养液，其中编码可溶性重组人PH20的细胞是DG44CHO细胞；且所述可溶性重组人PH20的氨基酸序列为SEQIDNOs:4-9之一的序列。7.权利要求1或2的收获的细胞培养液，通过包括以下的方法制备：a)用编码可溶性重组人PH20的细胞的接种物接种生物反应器中的细胞培养基以产生细胞培养物，其中：所述细胞包含150至300个拷贝的编码可溶性重组人PH20的核酸；所述生物反应器含有至少100升的细胞培养物；每100升细胞培养物中接种了约1010-1011个细胞；以及将所述细胞在设定的温度培养；b)用第一加料培养基给细胞加料，所述培养基含有葡萄糖、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、人胰岛素和酵母提取物，其量足以提高细胞生长及峰值细胞密度并提高可溶性重组人PH20的合成，其中将所述加料培养基以细胞培养物体积的0.5％至20％的体积加入到该培养物中；c)用第二加料培养基给细胞加料，所述培养基含有葡萄糖、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、酵母提取物和丁酸钠，其量足以提高可溶性重组人PH...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·贝克，L·布克班德，
申请(专利权)人：哈洛齐梅公司，
类型：发明
国别省市：美国,US