一种简单快速制备噬菌蛭弧菌生态制剂的方法技术

本发明专利技术公开了一种优化后的噬菌蛭弧菌制剂的制备方法。本方法通过申请人的反复研究并试验，通过挑取采用双层自来水琼脂平板筛选得到的噬菌蛭弧菌斑块，加入到200mL宿主菌悬液中于28℃、150rpm条件下振荡培养90h，得到的混合液即视作蛭弧菌悬液，此悬液可直接用于试验。整个制备过程简单快速，节约了时间和成本。

Method for simple and rapid preparation of biological agent for killing leech

The invention discloses a method for preparing an optimized phage preparation for Vibrio vulnificus. The method and research of the applicant through repeated tests, Bdellovibrios were using the double tap water by plaque agar plate screening, adding to the 200mL host bacterial suspension at 28 DEG C and 150rpm under the conditions of shaking culture 90h, the mixture is regarded as Bdellovibrios suspension, the suspension can be directly used for testing. The preparation process is simple and fast, and the time and cost are saved.

【技术实现步骤摘要】
一种简单快速制备噬菌蛭弧菌生态制剂的方法
本专利技术属于微生物
，具体涉及一种噬菌蛭弧菌的制备方法。
技术介绍
噬菌蛭弧菌(Bdellovibriobacteriovorus)是一类体形较小、呈短杆状或弧状，一端有极长鞭毛的、运动极活泼的革兰氏阴性菌，广泛分布于土壤、海水、污水、沉淀物等环境中，甚至在哺乳动物粪便中也有检出，其具有寄生和裂解宿主菌的生物学特性。它比一般的细菌小，因而能够侵入并裂解宿主细胞。实验证明，蛭弧菌对致病菌的裂解能力明显大于非致病菌，且肠道病原菌更易被裂解。此外，噬菌蛭弧菌也可在水体净化方面发挥一定的作用。近年来，随着养殖业的发展和养殖水体的污染，许多革兰氏阴性病原菌如嗜水气单胞菌等对水产动物造成了越来越严重的危害。蛭弧菌的这一特性，使其能够成为水产养殖业中一种良好的微生态制剂。据Wand等报道，在消除污水致病菌的过程中，蛭弧菌起到明显净化水体的作用，从而有效降低致病菌所带来的危害。宋志萍等报道蛭弧菌可用于控制九孔鲍苗的细菌性病害。同时，邵桂元等报道蛭弧菌对引起鲫鱼出病的点状产气单胞菌具有明显消除作用。因此，越来越多的学者试图开发以蛭弧菌作为原料的微生态制剂，以达到抑制病原菌的目的。目前有关蛭弧菌分离方法很多，但是一种简单又不影响蛭弧菌捕食活力的方法尚没有报道过，经过本专利技术人多次的试验验证，现报道一种简单快速制备噬菌蛭弧菌生态制剂的方法。
技术实现思路
专利技术目的：克服现有技术的不足，提供一种简单快速的噬菌蛭弧菌生态制剂的制备方法。为了解决上述技术不足的问题，本专利技术的目的通过以下技术措施实现：1.蛭弧菌的分离纯化：以EC600为宿主菌，采用液体培养和双层自来水琼脂平板相结合的方法从池塘水泥中分离获得噬菌蛭弧菌菌株，然后采用单个菌斑传代的方法进行液体培养，再结合双层自来水琼脂平板的方法进行10代的连续单个菌斑传代纯化，最终得到噬菌能力强、纯系的噬菌蛭弧菌菌株。2.步骤1中所述宿主菌液制备方法为：将EC600转入血琼脂平板，于35℃培养箱中培养18h。挑取单个菌落接种于200mLLB液体培养基中，于35℃、180rpm振荡培养箱中培养过夜。然后将菌液于8000×g条件下离心10min，沉淀用无菌自来水重悬，重复离心一次，用无菌自来水将浓度调至1010cfu/mL，于4℃保存备用。3.步骤1中所述双层琼脂平板的制备方法为：下层琼脂含量为2％，上层琼脂含量为0.6％，均用无菌自来水配制。4.噬菌蛭弧菌菌剂制备：挑取一块双层琼脂平板上的噬菌斑，接种于200mL无菌自来水配制的宿主菌悬液中，于30℃、150rpm条件下振荡培养90h，此时菌悬液即为噬菌蛭弧菌悬液。可将菌液直接用于试验操作也可将获得的菌液经0.45μm孔径膜过滤除菌后使用。本专利技术的优点及效果：与传统的蛭弧菌分离方法相比，省去了配制DNB、调节pH的步骤，可直接运用自来水进行配制，操作简单省时省料，经过试验验证，采用无菌自来水分离的蛭弧菌与传统方法分离的蛭弧菌在捕食能力和出斑时间上没有明显区别；大肠杆菌C600不属于致病菌，因此避免了可能的生物危害。具体实施方式应该指出，以下具体说明都是示例性性的，旨在对本专利技术提供进一步的说明。除非另有说明，本文所使用的所有科学和技术术语具有与本专利技术所属
人员通常理解的相同含义。下面结合具体实施例对本专利技术做进一步说明，但所举实施例不作为对本专利技术的限定。若为特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例一：分离自池塘污泥的噬菌蛭弧菌生态制剂的快速制备1.样本采集：收集池塘的淤泥，作为噬菌蛭弧菌分离株的菌株来源。2.宿主菌悬液的制备：将宿主菌EC600接种于LB液体培养基中，于35℃、180rpm条件下振荡培养18h，然后在8000r/min条件下离心10min，沉淀用无菌自来水重悬后即为宿主菌悬液，并用无菌自来水将浓度调至1010cfu/mL，4℃保存备用。3.蛭弧菌的分离：(1)将200mL无菌自来水加入到获得的淤泥样中，振荡混匀后取上清于500×g条件下离心10min，将获得的上清水样于4℃保存备用；(2)取50mL水样加入到200mL宿主菌悬液中，做三个重复。在30℃条件下静置培养90h。将培养好的菌液在3500rpm条件下离心15min，取上清进行双层琼脂平板法进行蛭弧菌分离试验；(3)双层琼脂平板配制：下层采用2％无菌自来水琼脂，倒入90mm平皿凝固后备用；上层采用0.6％无菌自来水琼脂于50℃保温备用。于10mL离心管中加入2mL宿主菌悬液，然后加入1mL水样，最后加入4mL上层琼脂，混匀后倾注于下层琼脂平板上，凝固后于30℃恒温培养箱倒置培养90h，期间连续观察出斑情况；(4)蛭弧菌纯化：由上述第(3)步获得的蛭弧菌存在不纯的情况，我们采用单个斑传代的方法对蛭弧菌进行双层琼脂平板的方法优化，挑选出斑时间短、菌斑大且透亮的作为试验用蛭弧菌菌株。(5)噬菌蛭弧菌菌剂制备：挑取步骤(4)所制备的噬菌斑一块，加入到EC600宿主菌悬液中，30℃、150rpm条件下振荡培养90h。此时获得的菌悬液即为噬菌蛭弧菌菌剂，可将此菌剂直接用于试验或经0.45μm孔径膜过滤后使用。(6)捕食能力检测：选取1株临床分离的肺炎克雷伯菌作为宿主菌，通过双层琼脂平板法和活菌计数的方法进行捕食能力的验证。实施例二：离自河流淤泥的噬菌蛭弧菌生态制剂的快速制备与实施例一不同的是步骤1收集河流淤泥，作为噬菌蛭弧菌分离株的菌株来源，按照实施例一的方法进行分离获得。本专利技术以上实施例仅用于对本次专利技术阐释，然而本专利技术的保护范围并非仅仅局限于以上实施例。本领域技术人员可以根据本专利技术作出各种改变或调整，只要不脱离本专利技术的精神，均应属于本专利技术所附权利要求的范围。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种噬菌蛭弧菌，其特征在于，从池塘淤泥中分离获取。

【技术特征摘要】
1.一种噬菌蛭弧菌，其特征在于，从池塘淤泥中分离获取。2.一种噬菌型菌剂，其特征在于，含有权利要求1中所述的噬菌蛭弧菌。3.根据权利要求2所述噬菌型菌剂，其特征在于，将分离得到的蛭弧菌加入到宿主菌悬液中培养即形成菌剂悬液。4.根据权利要求3所述的噬菌型菌剂，其特征在于，所述宿主菌悬液制备方法如下：将宿主菌EC600接种于LB液体培养基中，于35℃，180rpm条件下振荡培养18h，然后在8000r/min条件下离心10min，...

【专利技术属性】
技术研发人员：周铁丽，孙瑶，曹建明，
申请(专利权)人：温州医科大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：浙江,33