一种用于测定亚精胺/精胺N制造技术

一种用于测定亚精胺/精胺N

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种用于测定亚精胺/精胺N1-乙酰基转移酶活性的方法相关申请的交叉引用本申请要求在美国专利商标局2012年11月16日提交的临时申请的权益，其公开的内容通过引用的方式并入本申请，并且本申请要求该专利的优先权。
技术介绍

美国专利号6,811,967于2004年11月4日颁发给SITAR等人，其全部公开的内容通过引用合并于此。该专利公开了一种利用亚精胺/精胺N1-乙酰基转移酶(SSAT)的底物，通过检测SSAT底物的乙酰化形式来测定SSAT的活性的方法。SSAT的底物可能包括金刚胺，其中金刚胺产生乙酰化代谢产物N-乙酰基金刚胺的代谢的发生在一定程度上由可诱导的酶SSAT的行为引起。还公开了SSAT的活性与病理状况的相关性。SSAT普遍分布在哺乳动物组织中，并在细胞中聚胺的分解代谢和消除中起作用。SSAT是一种催化乙酰基从乙酰辅酶A转移到聚胺的氨丙基部分的诱导酶。SSAT的这一行为促进了聚胺的降解、排泄以及循环和/或细胞内循环。SSAT以这种方式参与维持哺乳动物细胞内聚胺的动态平衡。然而，在正常的或未经诱导的哺乳动物组织中SSAT以非常低的水平存在。可以通过不同的药物、生长因子、聚胺、聚胺类似物、有毒物质、激素和生理刺激诱导SSAT的表达。虽然所有上述化合物可以诱导SSAT的表达，但是对于每个单独的化合物,诱导发生的时间不同。SSAT表达的调节在转录、mRNA稳定、mRNA翻译和蛋白质稳定的水平发生。体外实验能成功地进行前，为使细胞中存在足够的SSAT酶通常需要SSAT的诱导或过表达或有100,000×g离心的上清液。目前的文献教导SSAT是一种对包括精胺和亚精胺或其类似物在内的底物特异性乙酰化酶，然而SSAT作用于非精胺/亚精胺底物的SSAT活性、SSAT的酶动力学以及测定方法还是没有被理解。现有量化SSAT活性的方法。然而，这些技术都依赖于技术高度熟练的人员和复杂的实验方法。更具体地说，一直存在对一种测定方法的需求，这种测定方法通过检测SSAT的非精胺/亚精胺底物的乙酰化形式来量化SSAT的活性，该方法可用于检测各种病理状况。
技术实现思路
本专利技术提供一种确定哺乳动物中精胺/亚精胺N1-乙酰基转移酶(SSAT)活性的方法，包括步骤：测定来自哺乳动物的样本中一种非精胺/亚精胺或其类似物、SSAT底物的乙酰化形式的水平。在该方法的第一个实施例中，SSAT底物是金刚乙胺，SSAT底物的乙酰化形式是乙酰基-金刚乙胺。该方法可以包括在1-10mg/kg，或者可选择地在3-6mg/kg范围内的特定SSAT底物剂量水平，将SSAT底物和哺乳动物的组织或细胞一起孵育。供测定的样本可以是来自于哺乳动物的尿液、血液和/或唾液，样本在底物孵育后的2-24小时采集，可选择地在孵育后的2-4小时。在该方法的第二个实施例中，SSAT底物是妥卡尼，SSAT底物的乙酰化形式是乙酰基-妥卡尼。该方法可以包括在1-10mg/kg，或者可选择地在3-6mg/kg范围的内的特定SSAT底物剂量水平，将SSAT底物和哺乳动物的组织或细胞一起孵育。供测定的样本可以是来自于哺乳动物的尿液、血液和/或唾液，样本在底物孵育后的2-24小时采集，可选择地在孵育后的2-4小时。在该方法的第三个实施例中，SSAT的活性在肝细胞中检测，所述方法包括以下步骤：a.获得肝细胞并在合适的培养物中孵育该肝细胞；以及b.用一种非精胺/亚精胺SSAT底物孵育该肝细胞；c.检测从该培养物中获得的样本中的一种乙酰化代谢产物；以及d.将该乙酰化代谢产物的存在量与SSAT活性相关联，其中该样本中的乙酰化代谢产物的存在量是哺乳动物体内SSAT活性的表征。药物可以是0-220μΜ浓度范围内的金刚乙胺。将该乙酰化代谢产物的存在量与SSAT活性相关联的步骤包括将该乙酰化代谢产物的量关联至一条标准曲线来确定在哺乳动物体内的SSAT活性水平。在该方法的第四个实施例中，SSAT活性在哺乳动物的细胞内测定。SSAT底物是金刚乙胺，SSAT底物的乙酰化形式是乙酰基-金刚乙胺。该方法包括以下步骤：a.将从细胞培养物中获得的测试样本与金刚乙胺接触；b.测量产生的乙酰化代谢产物的量；以及c.将产生的乙酰化代谢产物的量与SSAT的活性水平相关联。该细胞培养物可以是哺乳动物细胞培养物，测试样本可以是肝细胞。将从细胞培养物中获得的测试样本与药物接触的步骤可以包括用底物孵育样本大约24小时。在该方法的第五个实施例中，SSAT活性在哺乳动物中检测。该方法包括以下步骤：a.向哺乳动物体内引入金刚乙胺b.采集来自哺乳动物的生物体液样本c.检测该样本中的一种乙酰化代谢产物；以及d.将该乙酰化代谢产物的存在量与SSAT活性相关联，其中该样本中的乙酰化代谢产物的存在量是哺乳动物中SSAT活性的表征。该生物体液样本可以是，但不限于，血液、唾液和尿液。在该方法的第六个实施例中，SSAT活性在哺乳动物中检测。该方法包括以下步骤：a.向哺乳动物体内引入金刚乙胺b.采集来自哺乳动物的生物体液样本c.检测该样本中的一种乙酰化代谢产物；以及d.将该乙酰化代谢产物的存在量与SSAT活性相关联，其中该样本中的乙酰化代谢产物的存在水平是哺乳动物体内的癌细胞的表征。该生物体液样本可以是，但不限于，血液、唾液和尿液。在该方法的各实施例中，样本中非精胺/亚精胺底物的相对水平可以被关联至一条代表已知活性水平的标准曲线，并且可以通过多种技术测定，包括但不限于气相色谱、放射性标记、高压液相色谱(HPLC)、薄层色谱；质谱可以和具有特异性抗体或多种抗体的色谱以及亲和色谱联用。本文中公开的测定方法可用于将SSAT活性与哺乳动物体内的病理状况相关联，病理状况包括但不限于肺癌、胃癌、卵巢癌、急性髓细胞性白血病、淋巴瘤、乳腺癌、肾癌、结直肠癌和/或前列腺癌。附图说明通过以下给出的对具体实施方式的描述，仅以实施例的方式，并参照附图，本专利技术将更容易理解，其中：图1的表格显示了可接种的冻存原代大鼠肝细胞中SSAT介导的金刚胺、金刚乙胺、妥卡尼和亚精胺的N-乙酰化的参数(Km和Vmax)；图2的表格显示了金刚胺被SSATN-乙酰化的酶动力学数据；图3的表格显示了金刚乙胺被SSATN-乙酰化的酶动力学数据；图4的表格显示了妥卡尼被SSATN-乙酰化的酶动力学数据；图5的表格显示了亚精胺被SSATN-乙酰化的酶动力学数据；图6的表格显示了预实验中(二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-溴代四唑或MTT法测定的结果；图7的表格显示了验证实验中MTT法测定的结果；图8显示了金刚胺被SSATN-乙酰化的代谢产物的形成和Lineweaver-Burk曲线图；图9显示了金刚乙胺被SSATN-乙酰化的代谢产物的形成和Lineweaver-Burk曲线图；图10显示了妥卡尼被SSATN-乙酰化的代谢产物的形成和Lineweaver-Burk曲线图；图11显示了亚精胺被SSATN-乙酰化的代谢产物的形成和Lineweaver-Burk曲线图；图12显示了预实验中一次MTT测定的结果；图13显示了验证实验中一次MTT测定的结果；图14显示了定量孵育样本中N-乙酰金刚胺的代表性LC/MS/MS测定校准标准曲线；图15显示了定量孵育样本中N-乙酰金刚乙胺的代表性LC/MS/MS本文档来自技高网...

【技术保护点】
金刚乙胺在制备测定哺乳动物中精胺/亚精胺N

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.11.16 US 61/560,7001.金刚乙胺在制备测定哺乳动物中精胺/亚精胺N1-乙酰基转移酶(SSAT)活性的分析试样中的应用，其中测定步骤包括：向所述哺乳动物中引入金刚乙胺；从所述哺乳动物采集生物样本；检测所述生物样本中所述金刚乙胺的乙酰化代谢产物；将所述生物样本中所述金刚乙胺的所述乙酰化代谢产物的存在量与所述哺乳动物中的SSAT活性相关联。2.如权利要求1所述的应用，其中，所述哺乳动物中的SSAT活性与病理状况相关联。3.如权利要求1所述的应用，其中，所述哺乳动物中的SSAT活性与癌症相关联。4.金刚乙胺在制备测定哺乳动物中精胺/亚精胺N1-乙酰基转移酶(SSAT)活性的分析试样中的应用，其中测定步骤包括...

【专利技术属性】
技术研发人员：布莱恩·郑，拉希德·巴克斯，丹尼尔·西塔尔，
申请(专利权)人：百奥马克科技有限公司，
类型：发明
国别省市：加拿大,CA