一种青枯菌的LAMP检测引物组合及其LAMP检测试剂盒和LAMP方法技术

本发明专利技术公开了一种检测青枯菌的LAMP引物组合和LAMP检测试剂盒和LAMP检测方法。该LAMP引物组合由正向外引物F3，反向外引物B3，正向内引物FIP，反向内引物BIP组成。本发明专利技术的检测方法可同时检测所有青枯菌，并且特异性强、准确性高、操作简便、实用性好、实现了等温扩增，可用于青枯菌的高灵敏度快速检测，易于大规模推广。

LAMP detection primer combination of Ralstonia solanacearum and LAMP detection kit and LAMP method thereof

The invention discloses a LAMP primer combination for detecting Ralstonia solanacearum and a LAMP detection kit and a LAMP detection method. The LAMP primer combination consists of the positive outward primer F3, the reverse outer primer B3, the forward inner primer FIP, and the reverse inner primer BIP. The detection method of the invention can simultaneously detect all R.solanacearum, and strong specificity, high accuracy, simple operation, good practicability, realizes the isothermal amplification, can be used for rapid detection of Ralstonia solanacearum in high sensitivity, easy to large-scale promotion.

【技术实现步骤摘要】
一种青枯菌的LAMP检测引物组合及其LAMP检测试剂盒和LAMP方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种青枯菌(Ralstoniasolanacearum)的LAMP检测引物组合及其LAMP检测试剂盒和LAMP方法。
技术介绍
植物细菌性青枯病(Bacterialwiltofplants)，是由茄科雷尔氏菌(RalstoniasolanacearumYabuuchietal.，简称青枯菌)引起的一种世界性重大病害。青枯病于上世纪30年代在我国首次被报道；上世纪50年代，该病仅分布于我国长江流域。但迄今为止，南起20°N的海南省、北至42°N的河北坝上地区均有其造成危害的报道(徐进等，2013)。作为复合种，青枯菌寄主范围广泛，可侵染54个科的450余种植物(Wickeretal.，2007)。其中经济上重要的寄主包括马铃薯、西红柿、辣椒、茄子、烟草、生姜、桑树和香蕉等。国内最为常用的青枯菌检测方法是平板划线分离技术，该方法简单廉价。但费时费力，且操作人员需具备准确识别青枯菌菌落形态的能力。血清学检测技术是基于抗原与抗体的专一性识别与结合，它利用抗体与抗原产生的凝集反应、沉淀反应等对靶标病原菌作出快速有效的诊断与鉴定。已报道用于青枯菌检测的血清学方法，包括酶联免疫吸附(ELISA)、免疫萤光(IF)、荧光原位杂交(FISH)以及免疫试纸条(Immuno-strip)等。美国阿格迪(Agdia)公司商品化生产的ELISA试剂盒和免疫试纸条在欧美一些国家已被用于室内及田间青枯病疑似样品的初步筛查。但此类方法的缺点在于价格昂贵，检测灵敏度不高。如Agdia的检测试纸条每个样品的检测成本约￥50，检测灵敏度阈值一般在106-107cfu/mlH2O。基于植物病原细菌核酸序列(Nucleicacid-based)的分子检测和鉴定方法主要包括：PCR(PolymeraseChainReaction，PCR)、DNA指纹、DNA芯片以及DNA条形码技术等。上世纪90年代以来，随着PCR技术日臻成熟，基于该技术的快速分子诊断方法，被广泛应用于包括青枯菌在内的植物病原细菌研究领域。较常规平板划线分离和血清学检测方法，PCR检测更为精准、高效和灵敏。迄今为止，国内外相关研究通过抑制性差减杂交(SuppressionSubtractiveHybridization，SSH)、比较基因组学(ComparativeGenomics)和DNA指纹图谱等研究手段，分别以青枯菌的16S和23SrRNA基因及其间隔区(InternalTransgenicSpacer，ITS)、flicC和lpxC等功能基因、未知功能片断(Anonymoussequence)以及菌株特有基因(strain-specificgene)等作为PCR扩增靶标，设计出了近30套用于青枯菌种及种以下分类单元(演化型、生理小种和生化变种)的特异性检测引物或探针。在种水平上，Opina等基于随机扩增片段长度多态性(Randomamplifiedpolymorphism，RAPD)的分析结果，锚定了青枯菌lpxC基因及其上游部分序列，设计的PCR扩增引物Au759/760，因其在青枯菌种水平鉴定上具有高度的特异性和广泛的通用性，因此被国内外相关研究者广为采用；Seal和Pastrik分别基于16SrRNA基因建立的单一PCR和PCR/RFLP检测方法也比较具有代表性，被欧洲和地中海植物保护组织推荐作为青枯菌的分子鉴定方法。环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是一种新的等温扩增技术，因其操作简单快速、特异性、灵敏度高、成本低等特点，逐渐成为可以替代传统PCR的新的核酸扩增检测技术。它是针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，利用BstDNA聚合酶的链置换活性在同一反应体系中恒温高效扩增，大量合成目的DNA的同时，产生副产物-白色焦磷酸镁沉淀。由于扩增反应依赖于靶DNA的6个独立的区域，因此特异性非常高，反应在等温条件下进行，则不需要PCR仪等昂贵设备，仅用水浴锅等能够维持稳定恒温的设备即可完成，检测成本大大降低，应用范围显著扩大，可以在田间进行实时监测。
技术实现思路
专利技术目的：针对以上存在的问题，本专利技术的目的是提供一组LAMP引物组合，能够检测植物病原青枯菌。本专利技术的另一目的是提供上述青枯菌的LAMP检测试剂盒。本专利技术的另一目的是提供上述青枯菌的LAMP检测方法。技术方案：为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：一种用于青枯菌的LAMP引物组合，由正向外引物F3，反向外引物B3，正向内引物FIP，反向内引物BIP和反向环引物LB组成，各引物序列如下：FIP：5’-TACGCCGTTTCATCGGCCAGGTACACGGCGCACAAGT-3’；BIP：5’-ATCGTCACGTTCGACAAGGTGGAATGCCGGCTGCAACTG-3’；F3：5’-CCTGTACGTGGTCGGCTAT-3’；B3：5’-ACCGCAACACGGGATCA-3’；所述引物组合在检测青枯菌中的应用。一种检测青枯菌的LAMP试剂盒，包含以下成分：(1)包含上述引物组合的引物混合液，浓度分别为：正向外引物F31μM、反向外引物B31μM、正向内引物FIP8μM、反向内引物FIP8μM；(2)反应液及染料，包含：7mMdNTPs、100mMTris-HCl，50mMKCl，50mM(NH4)2SO4，40mMMgSO4、0.5％TritonX-100、5MBetain、40UBstDNA聚合酶，SYBRGreenI；(3)阳性对照为青枯菌GMI1000菌株的基因组DNA，阴性对照为不含目的基因的反应混合液。所述的检测青枯菌的LAMP试剂盒在检测青枯菌中的应用一种检测青枯菌的方法，包括以DNA为模板，利用LAMP引物组或LAMP试剂盒进行LAMP扩增，观察反应溶液的颜色变化，显示橙色表示检测为阴性，不存在青枯菌，而显示绿色的为阳性，样品中存在青枯菌。所述的检测青枯菌的方法，提取待测样品的总DNA，取1μLDNA溶液，加入5μL反应液、5μL引物液、14μL灭菌超纯水进行LAMP反应，反应程序为60～65℃，时间为30～50min，反应结束后加入染料观察颜色变化。本专利技术检测青枯菌的方法，包括待测样品DNA的提取，以DNA为模板，利用所述引物组合进行LAMP反应。SYBRGreenI是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下，SYBRGreenI发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBRGreenI的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，反应结束后通过反应体系的颜色变化判断青枯菌的有无。显示橙色表示检测为阴性，不存在青枯菌，而显示绿色的为阳性，样品中存在青枯菌。本专利技术的关键技术之一是青枯菌的高效特异扩增引物序列及其扩增方法。为了验证引物序列的特异性，本专利技术以24株青枯菌和4株非青枯菌菌株为供试材料(表1和表2)，当发生LAMP反应时，产生大量的焦磷酸镁沉淀导致浊度上升。通过SYBRGreenI显色反应结果所示，青枯菌样品反应管里均为绿色本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于青枯菌的LAMP引物组合，其特征在于由正向外引物F3，反向外引物B3，正向内引物FIP，反向内引物BIP，各引物序列如下：FIP：5’‑TACGCCGTTTCATCGGCCAGGTACACGGCGCACAAGT‑3’；BIP：5’‑ATCGTCACGTTCGACAAGGTGGAATGCCGGCTGCAACTG‑3’；F3：5’‑CCTGTACGTGGTCGGCTAT‑3’；B3：5’‑ACCGCAACACGGGATCA‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种用于青枯菌的LAMP引物组合，其特征在于由正向外引物F3，反向外引物B3，正向内引物FIP，反向内引物BIP，各引物序列如下：FIP：5’-TACGCCGTTTCATCGGCCAGGTACACGGCGCACAAGT-3’；BIP：5’-ATCGTCACGTTCGACAAGGTGGAATGCCGGCTGCAACTG-3’；F3：5’-CCTGTACGTGGTCGGCTAT-3’；B3：5’-ACCGCAACACGGGATCA-3’。2.权利要求1所述引物组合在检测青枯菌中的应用。3.一种检测青枯菌的LAMP试剂盒，其特征在于，包含以下成分：(1)含权利要求1所述的引物组混合液，浓度分别为：正向外引物F31μM、反向外引物B31μM、正向内引物FIP8μM、反向内引物FIP8μM；(2)反应液及染料，包含：7mMdNTPs、100mMTris-HCl，50...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄雯，张昊，徐进，冯洁，许景升，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11