海洋生物提取物抗肿瘤活性的测定方法技术

本发明专利技术涉及一种海洋生物提取物抗肿瘤活性的测定方法，包括如下步骤：（1）取对数生长期的贴壁的肿瘤细胞，制成单细胞悬液；离心去上清，再加入RPMI 1640培养液再次吹打沉淀中的细胞，使之形成单细胞悬液；（2）将细胞浓度稀释至5×10

Method for determination of antitumor activity of marine biological extracts

The invention relates to a method for the determination of antitumor activity of a marine biological extract, which comprises the following steps: (1) adherent logarithmic growth phase of tumor cells into single cell suspension; centrifugation to supernatant, adding RPMI 1640 medium was treated again precipitated in the cell, so as to form a single cell suspension; (2) the cell concentration was diluted to 5 x 10

【技术实现步骤摘要】
海洋生物提取物抗肿瘤活性的测定方法
本专利技术属于海洋生物医药
，具体涉及一种海洋生物提取物抗肿瘤活性的测定方法。
技术介绍
恶性肿瘤严重威胁着人类的生命和健康，是当今人类社会的第一杀手，随着人类生活水平的提高和人类平均寿命的增长，现代社会生活节奏的不断加快、生活方式的改变、环境的污染，恶性肿瘤的发病率和致死率不断升高，世界卫生组织在2008年国际肿瘤学年会上提出，到2010年癌症将取代心血管疾病而成为导致人类死亡的第一杀手。肿瘤细胞的特点是：无限制、无止境地快速增殖，使患者体内的营养物质被大量消耗；癌细胞释放出多种毒素，使人体产生一系列症状；癌细胞还可转移到全身各处迅速生长增殖，导致人体消瘦、无力、食欲不振、发热以及严重的脏器功能受损等，患者最终因为器官功能衰竭而死亡。WHO报道，2004年，约有740万人死于癌症，占世界所有死亡人口总数的13%。并且癌症引起的死亡率在不断上升，预计2030年，将有1200万人死于恶性肿瘤。每年引起较高死亡率的癌症有:肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌和乳腺癌。海洋是世界上万物的生命之源，约占地球表面积的71%，存在着地球上最丰富的生物资源，其生物多样性远远超过陆地生物。据估计，海洋中蕴藏着地球上80%的生物资源，约有30门50多万种。在漫长的生命进化过程中，为了适应高盐、高压、低温、低光照且变化多端的海洋生态环境，海洋生物的代谢系统和机体防御系统慢慢演化，进化成与陆地生物截然不同，并产生了许多结构独特且药理作用显著的海洋生物次生代谢产物，包括脂类、酸类、苷类、多糖类、萜类、胡萝卜素类、甾类、生物碱、有机酸和蛋白多肽类等。这些生物活性物质的主要作用是预防潜在天敌的进攻,避免海洋微生物及浮游杂物的附着,以及在物种之间传递信息。这些新型的活性物质已被证明具有良好的医学应用前景，比如具有抗菌、抗肿瘤、抗艾滋病、抗病毒、防治心血管疾病、延缓衰老及免疫调节等功能。在海洋活性物质的研究中，海洋来源的抗肿瘤药物研究一直占据着主导作用。科学家们预言，海洋将是最有前途的抗肿瘤药物来源地。
技术实现思路
根据现在的研究进展，本专利技术旨在提供一种海洋生物提取物抗肿瘤活性的测定方法。一种海洋生物提取物抗肿瘤活性的测定方法，包括如下步骤：（1）取对数生长期的贴壁的肿瘤细胞，倒掉残留的旧培养液；加入胰酶消化3-5min；在消化后的细胞中加入含1%FBS的RPMI1640培养液反复吹打至形成单细胞悬液；用1000r/min的低速离心5min；弃去上清，再加入6mLRPMI1640培养液再次吹打沉淀中的细胞，使之形成单细胞悬液；（2）用血球计数板对细胞计数，将细胞浓度稀释至5×104ml-1左右；（3）将细胞加入96孔培养板中，每个孔加入100µl；置于37℃恒温培养箱中培养24h；（4）加入海洋生物提取物样品，样品溶液先经过微孔滤膜过滤除菌，用RPMI1640培养液将样品稀释成5个浓度梯度，每孔加入180µL，4个平行孔；（5）在37℃，48h培养后，用移液枪将96孔板中液体洗净后每孔加入1mg/mlMTT100µl，置CO2培养箱37℃培养4h；（6）弃去MTT用RPMI1640洗板一次后，每孔加入DMSO200µl，置摇床摇匀30min；最后用酶标仪在570nm下检测；（7）实验重复3次，数据以均值±SD表示，并用统计学上方差分析的方法对标准差进行计算。采用四氮唑盐[3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide，MTT]法测定海洋生物提取物对肿瘤细胞的细胞毒作用。四氮唑盐是一种能接受氢原子的染料。活细胞的线粒体中与NADH有关的脱氢酶在细胞内可将黄色的MTT转化成不溶性的蓝紫色的甲臜（formazan），而死细胞则没有此功能。因此用二甲亚砜（DMSO）溶解甲臜后，摇匀30分钟。用可调波长式微孔板酶标仪以570nm作为检测波长，630nm作为参比波长测定OD值，结果以细胞毒百分率表示：细胞毒百分率（％）＝（OD值对照孔-OD值给药孔）/OD值对照孔×100%；实验重复3次，数据以均值±SD表示。本专利技术的测定方法简单快速，测定结果准确。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步详细说明。一种海洋生物提取物抗肿瘤活性的测定方法，包括如下步骤：（1）取对数生长期的贴壁的肿瘤细胞，倒掉残留的旧培养液；加入胰酶消化3-5min；在消化后的细胞中加入含1%FBS的RPMI1640培养液反复吹打至形成单细胞悬液；用1000r/min的低速离心5min；弃去上清，再加入6mLRPMI1640培养液再次吹打沉淀中的细胞，使之形成单细胞悬液；（2）用血球计数板对细胞计数，将细胞浓度稀释至5×104ml-1左右；（3）将细胞加入96孔培养板中，每个孔加入100µl；置于37℃恒温培养箱中培养24h；（4）加入海洋生物提取物样品，样品溶液先经过微孔滤膜过滤除菌，用RPMI1640培养液将样品稀释成5个浓度梯度，每孔加入180µL，4个平行孔；（5）在37℃，48h培养后，用移液枪将96孔板中液体洗净后每孔加入1mg/mlMTT100µl，置CO2培养箱37℃培养4h；（6）弃去MTT用RPMI1640洗板一次后，每孔加入DMSO200µl，置摇床摇匀30min；最后用酶标仪在570nm下检测；（7）实验重复3次，数据以均值±SD表示，并用统计学上方差分析的方法对标准差进行计算。采用四氮唑盐[3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide，MTT]法测定海洋生物提取物对肿瘤细胞的细胞毒作用。四氮唑盐是一种能接受氢原子的染料。活细胞的线粒体中与NADH有关的脱氢酶在细胞内可将黄色的MTT转化成不溶性的蓝紫色的甲臜（formazan），而死细胞则没有此功能。因此用二甲亚砜（DMSO）溶解甲臜后，摇匀30分钟。用可调波长式微孔板酶标仪以570nm作为检测波长，630nm作为参比波长测定OD值，结果以细胞毒百分率表示：细胞毒百分率（％）＝（OD值对照孔-OD值给药孔）/OD值对照孔×100%；实验重复3次，数据以均值±SD表示。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种海洋生物提取物抗肿瘤活性的测定方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）取对数生长期的贴壁的肿瘤细胞，倒掉残留的旧培养液；加入胰酶消化3‑5min；在消化后的细胞中加入含1% FBS的RPMI 1640培养液反复吹打至形成单细胞悬液；用1000r/min的低速离心5min；弃去上清，再加入6mL RPMI 1640培养液再次吹打沉淀中的细胞，使之形成单细胞悬液；（2）用血球计数板对细胞计数，将细胞浓度稀释至5×10

【技术特征摘要】
1.一种海洋生物提取物抗肿瘤活性的测定方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）取对数生长期的贴壁的肿瘤细胞，倒掉残留的旧培养液；加入胰酶消化3-5min；在消化后的细胞中加入含1%FBS的RPMI1640培养液反复吹打至形成单细胞悬液；用1000r/min的低速离心5min；弃去上清，再加入6mLRPMI1640培养液再次吹打沉淀中的细胞，使之形成单细胞悬液；（2）用血球计数板对细胞计数，将细胞浓度稀释至5×104ml-1左右；（3）将细胞加入96孔培养板中，每个孔加入100µl；置于37℃恒温培养箱中培养24h；（4）加入海洋生物提取物样品，样品溶液先经过微孔滤膜过滤除菌，用RPMI16...

【专利技术属性】
技术研发人员：褚方强，
申请(专利权)人：青岛清泉生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37