一种用于核酸纯化或片段筛选的试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术公开了一种用于核酸纯化或片段筛选的试剂盒，其包括磁珠溶液、洗涤试剂和洗脱试剂；其中，所述磁珠溶液包含浓度为1～100ng/μL的氧化硅羧基磁珠、浓度为0.1～100mol/L的氯化钠、体积百分比浓度为1％～50％的聚乙二醇和缓冲液。本发明专利技术还公开了使用所述试剂盒进行核酸纯化和片段筛选的方法。本发明专利技术的试剂盒用磁珠法进行核酸纯化与片段筛选操作，不受通量限制，可以实现高通量，同时本发明专利技术基于磁珠的磁性特性，可配合自动化操作仪器进行自动化操作。

Kit for nucleic acid purification or fragment screening and method of use thereof

The invention discloses a method for purification of nucleic acid or fragment screening kit, which includes beads solution, washing and elution reagent kit; among them, the magnetic solution containing a concentration of 1 to silica beads, 100ng/ L carboxyl concentration is 0.1 ~ 100mol/L, the volume percentage of sodium chloride concentration is 1% ~ 50% peg and buffer. The present invention also discloses a method for nucleic acid purification and fragment screening using the kit. The kit of the invention magnetic beads were used for nucleic acid purification and screening of fragments from the flux limit can achieve high throughput at the same time, the magnetic properties of magnetic bead based, with automation instrument automation.

【技术实现步骤摘要】
一种用于核酸纯化或片段筛选的试剂盒及其使用方法
本专利技术属于生物
，尤其涉及一种用于核酸纯化或片段筛选的试剂盒及其使用方法。
技术介绍
高通量测序技术，即下一代测序技术(nextgenerationsequencing)能一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定及量化，为基础生物医学研究和临床检测提供了一个强大的工具，并推动基因组学的科学研究和临床转化，奠定了其在精准医学的基石地位。而一个待检样品在走上高通量DNA测序机器测序前还需要做大量的工作，其中的关键步骤就是文库构建。文库构建包括核酸片段化、修复反应、加A反应、连接反应、片段筛选与纯化、PCR扩增、PCR产物纯化、文库质检等过程，这些过程需要做大量的核酸纯化及片段筛选的工作。目前核酸纯化及片段筛选的方法有胶回收法、离心柱法等。胶回收法是根据凝胶电泳中不同片段大小的核酸在凝胶上的泳动距离不同而通过对含特定大小核酸片段的凝胶切割下来，再将切割下来的凝胶中的核酸分离纯化出来，达到核酸片段选择纯化的目的。离心柱法是利用硅胶膜配合特定的溶液环境来吸附核酸片段而达到核酸片段选择纯化的目的。但这些方法存在操作繁琐，耗时，或需要凝胶电泳或需要离心，无法实现高通量、自动化操作。胶回收法首先需要制备凝胶、电泳、切胶、回收等过程需要消耗大量的时间、花费不少人力操作成本。离心柱法一般需要吸附、洗涤、洗脱等步骤，其间需要大量的离心操作步骤，每次离心5min左右，而离心机的通量有限，限制了操作的简便性，当然少量样品以上两种方法可以是种选择，但当需要实现批量操作的时候，以上方法无法满足。
技术实现思路
一方面，本专利技术的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了一种用于核酸纯化或片段筛选的试剂盒，本专利技术的试剂盒用磁珠法进行核酸纯化与片段筛选操作，不受通量限制，可以实现高通量，同时本专利技术基于磁珠的磁性特性，可配合自动化操作仪器进行自动化操作。本专利技术采用的技术方案为：一种用于核酸纯化或片段筛选的试剂盒，包括磁珠溶液、洗涤试剂和洗脱试剂；其中，所述磁珠溶液包含浓度为1～100ng/μL的氧化硅羧基磁珠、0.1～100mol/L的氯化钠、体积百分比浓度为1％～50％的聚乙二醇和缓冲液。作为对上述技术方案的进一步改进，所述缓冲液为pH为5.5～6.5的1～100mol/L三羟基甲烷-盐酸。所述PH优选为6.0。作为对上述技术方案的进一步改进，所述聚乙二醇的分子量为5000～10000道尔顿，优选为8000道尔顿。PEG最早应用于提纯免疫球蛋白(IgG)和沉淀一些细菌病毒，近年来逐渐应用于核酸和酶的分离纯化，特别是用PEG分离质粒DNA，已相当普遍。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA，可以在500ulDNA液中加入200ul20％PEG8000(含1.2mol/LNaCl)，冰浴20min。该操作的优点在于：操作条件温和，不易引起生物大分子的变性。同时具有极高的沉淀效能，少量的PEG可以沉淀相当多的生物大分子。作为对上述技术方案的进一步改进，所述氧化硅羧基磁珠的浓度为5～50ng/μL，所述氯化钠的浓度为0.5～10mol/L，所述聚乙二醇的体积百分比浓度为2％～30％。各组分在以上浓度范围内时，试剂盒的使用效果更佳，对盐、引物、引物二聚体、dNTPs、小片段的DNA分子等去除效率更高，对目标片段的回收率更高。作为对上述技术方案的进一步改进，所述洗涤试剂包含体积百分比浓度为1％～85％的乙醇，1～100mmol/L氯化钠，0.1～10mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，pH为7.5～8.5的0.1～10mmol/L三羟基甲烷-盐酸。三羟基甲烷-盐酸的pH优选为8.0。作为对上述技术方案的进一步改进，所述洗脱试剂含有pH为8.0～9.0的0.1～10mmol/L三羟基甲烷-盐酸。三羟基甲烷-盐酸的pH优选为8.5。另一方面，本专利技术还提供了使用以上所述的试剂盒进行核酸纯化的方法，其包括以下步骤：1)向盛有待纯化核酸样品的反应管中加入所述磁珠溶液，混匀，室温下静置3～10min；2)将所述反应管置于磁力架，静置2～5min，待溶液澄清后，吸走上清液；3)向所述反应管中加入所述洗涤试剂，室温静置20～60s，吸走上清液；此步骤至少进行一次；4)保持所述反应管置于磁力架上状态，室温开盖晾干2～5min；5)将所述反应管从磁力架上取下来，加入洗脱试剂，混匀，室温静置2～6min；6)将所述反应管重新放置在磁力架上，室温静置1～3min，上清液即纯化后的DNA产物。作为对上述技术方案的进一步改进，所述步骤1)中，磁珠溶液的加入体积为待纯化核酸样品体积的0.5～2倍，优选为1.8倍。又一方面，本专利技术还提供了使用以上所述的试剂盒进行片段筛选的方法，其包括以下步骤：1')将第一轮磁珠溶液加入盛有待筛选核酸样品的反应管中，混匀，室温下静置3～10min；2')将所述反应管放置在磁力架上，静置2～5min，待溶液澄清后将上清液转移置新的反应管；3')向上述装有上清液的反应管加入第二轮磁珠溶液，室温静置3～10min，置于磁力架上，静置2～5min，待溶液澄清后吸走上清液；所述第一轮磁珠溶液与第二轮磁珠溶液的总和即为所述磁珠溶液；4')向反应管中加入洗涤试剂，室温静置20～60s，吸走上清液；此步骤至少进行一次；5')保持反应管置于磁力架上状态，室温开盖晾干2～5min；6')将反应管从磁力架上取下来，加入洗脱试剂，混匀，室温静置2～6min；7')将反应管重新放置在磁力架上，室温静置1～3min，上清液即筛选的核酸片段。作为对上述技术方案的进一步改进，所述第一轮磁珠溶液的加入量为待筛选核酸样品体积的0.4～0.8倍，所述第二轮磁珠溶液的加入量为待筛选核酸样品体积的0.1～0.3倍，所述筛选的核酸片段的平均长度为250～700bp。作为对上述技术方案的进一步改进，所述第一轮磁珠溶液的加入量、第二轮磁珠溶液的加入量与对应的筛选的核酸片段的平均长度如下表所示：表中”ד表示待筛选核酸样品的体积。相对于现有技术，本专利技术的有益效果为：1)实现高通量：本专利技术用磁珠法进行核酸纯化与片段筛选操作，不受通量限制，可以实现高通量。2)实现自动化：本专利技术基于磁珠的磁性特性，可配合自动化操作仪器进先自动化操作。3)实现核酸纯化：本专利技术中的吸附试剂在特定的溶液环境下(高盐低PH)对核酸样品中的大片段DNA的结合效率优于小片段DNA，基于这一特性，可通过调节吸附试剂的加入比例，选择性地去除盐、引物、引物二聚体、dNTPs、小片段的DNA分子等。4)实现片段筛选：本专利技术中的吸附试剂加入待纯化的核酸样品的比例越小，对于中小DNA片段的吸附能力越小，通过配合操作流程，两次加入不同比例的吸附试剂，可实现一定长度范围的核酸片段筛选。附图说明图1为核酸纯化方法的流程示意图；图2为片段筛选方法的流程示意图；图3显示了不同的磁珠溶液的加入比例对核酸样品的纯化效果的影响；图4显示了分别使用AMPureXP磁珠和本专利技术的试剂盒进行核酸纯化的结果；图5显示了使用本专利技术的试剂盒进行3个不同批次的试验所得的核酸纯化结果；图6显示了不同条件下的磁珠片段筛选结果。具体实施方式二代测序如火如荼，但文库制备仍然繁琐，核酸纯化与片段筛选作为文库构建的一个本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于核酸纯化或片段筛选的试剂盒，其特征在于：包括磁珠溶液、洗涤试剂和洗脱试剂；其中，所述磁珠溶液包含浓度为1～100ng/μL的氧化硅羧基磁珠、浓度为0.1～100mol/L的氯化钠、体积百分比浓度为1％～50％的聚乙二醇和缓冲液。

【技术特征摘要】
1.一种用于核酸纯化或片段筛选的试剂盒，其特征在于：包括磁珠溶液、洗涤试剂和洗脱试剂；其中，所述磁珠溶液包含浓度为1～100ng/μL的氧化硅羧基磁珠、浓度为0.1～100mol/L的氯化钠、体积百分比浓度为1％～50％的聚乙二醇和缓冲液。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述缓冲液为pH为5.5～6.5的1～100mol/L三羟基甲烷-盐酸。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述聚乙二醇的分子量为5000～10000道尔顿，优选为8000道尔顿。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述氧化硅羧基磁珠的浓度为5～50ng/μL，所述氯化钠的浓度为0.5～10mol/L，所述聚乙二醇的体积百分比浓度为2％～30％。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述洗涤试剂包含体积百分比浓度为1％～85％的乙醇，1～100mmol/L氯化钠，0.1～10mmol/L乙二胺四乙酸，pH为7.5～8.5的0.1～10mmol/L三羟基甲烷-盐酸；所述洗脱试剂含有pH为8.0～9.0的0.1～10mmol/L三羟基甲烷-盐酸。6.使用权利要求1～5中任一项所述的试剂盒进行核酸纯化的方法，其特征在于：包括以下步骤：1)向盛有待纯化核酸样品的反应管中加入所述磁珠溶液，混匀，室温下静置3～10min；2)将所述反应管置于磁力架，静置2～5min，待溶液澄清后，吸走上清液；3)向所述反应管中加入所述洗涤试剂，室温静置20～60s，吸走上清液；此步骤至少进行一次；4)保持所述反应管置于磁力架上状态，室温开盖晾干2～5min；5)将所述反应管从磁力架上取下来，加入洗脱试...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔晓锋，
申请(专利权)人：广东一氪生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44