一种葡萄内生真菌及其防治葡萄灰霉病的应用制造技术

本发明专利技术中公开了一种葡萄内生真菌及其用于防治葡萄灰霉病的应用，该葡萄内生真菌命名为疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)。该生物防治菌株疣孢漆斑菌是葡萄自身携带的内生真菌，可完全克服使用化学农药防治所带来的诸多问题，有利于葡萄无公害、绿色生产、有利于提高葡萄果实的商品性、节省成本，具有潜在的应用前景。对峙培养和抑菌实验都显示该生物防治菌株对葡萄灰霉菌的生长发育有较好的抑制作用，活体实验也显示菌剂喷施在葡萄品种后，防治效果明显，而且具有安全、无环境污染等优点，可应用于葡萄灰霉病的防治。

Endophytic fungus of grape and its application in preventing and treating Botrytis cinerea

The invention discloses a fungus and for grape Botrytis cinerea control application, the grape endophytic fungi named Myrothecium Verrucaria (Myrothecium Verrucaria). The Biocontrol Strain of Myrothecium Verrucaria is grape carried by the endophytic fungi, can completely overcome the problems caused by the use of chemical pesticides to control, is conducive to grape pollution-free, green production, improve commodity, save the cost of grape fruit, has a potential application prospect. Dual culture and antibacterial experiments show that the biocontrol strains had good inhibitory effect on the development of grape grey mold growth, in vivo experiments also showed that spraying agent in grape varieties, and obvious effect, and has the advantages of safety, no environmental pollution prevention and control, can be applied to grape Botrytis cinerea.

【技术实现步骤摘要】
一种葡萄内生真菌及其防治葡萄灰霉病的应用
本专利技术涉及一种用于植物病害防控
，具体涉及一种葡萄内生真菌及其防治葡萄灰霉病的应用。
技术介绍
葡萄在世界水果生产中占有重要的位置，我国鲜食葡萄年产量多年来一直位居世界各国首位，而葡萄灰霉病不仅是生产田中常见病害，更是产后贮藏过程中的毁灭性病害。因此，葡萄灰霉病已经是制约我国葡萄生产的一大障碍，更是保护地葡萄生产和葡萄贮藏期最为重要的病害种类之一，每年该病造成了巨大的经济损失。葡萄灰霉菌，有性态为富氏葡萄孢盘菌[Botryotiniafuckeliana(deBary)Whetzel.]，属子囊菌亚门葡萄孢盘菌属。无性态为灰葡萄孢霉(BotrytiscinereaPers.)，属半知菌亚门葡萄孢属。主要危害葡萄叶片，花穗和果实。叶片受害，初期即出现绿豆粒大的灰色斑点，扩大后成为淡褐色不规则斑片，潮湿时生有不规则灰霉层；花序发病后软腐并萎蔫，甚至整个花序坏死；果粒发病时出现褐色褪色斑点，病斑果皮易裂开，果皮易与果肉分离脱落。灰霉病菌腐生性强，寄主范围广，不同寄主植物间的灰霉病菌可相互引发灰霉病。目前，对灰霉病菌的防治主要以化学防治为主，辅以生物防治和生态防治。化学防治往往导致病菌对杀菌剂产生抗药性，效果下降，使用浓度不断增多，导致环境和食品安全等诸多问题。灰葡萄孢菌因其具有高的基因漂移潜力和较大的种群尺度，容易产生抗药性。无公害、绿色农产品越来越受到人们的重视，而生物防治由于低污染、低残留的特性，成为目前研究的重点。研究表明一些真菌(如木霉菌和链霉菌)和细菌(如芽孢杆菌)对灰霉菌有一定的拮抗作用。植物是筛选天然药物最主要的原料，内生真菌是指能够在健康植物组织内并与植物建立和谐关系的一类微生物，能够定殖在植物细胞间隙或细胞内，但不会对植物造成实质性的危害。植物内生菌长期生活在植物体内的特殊环境中，与宿主协同进化，在演化过程中二者形成了稳定的生态关系，一方面内生菌可从宿主中吸收营养供自己生长需要，另一方面内生菌在宿主的生长发育和系统演化过程中起重要作用，可通过自身的代谢产物或借助于信号转导对植物体产生影响。内生菌具有种类繁多、易于定殖、发挥作用持久等特点，使得其在防治病害的过程中发挥了重大作用。有研究表明内生菌可以增强宿主植物的抗病性，是现代药物的重要来源之一。目前已经有防治葡萄灰霉病的报道，如通过化学杀菌剂组合物防治葡萄灰霉病(中国专利，公开号CN201410543678.4，CN201310299766.X)，另外还有通过加强栽培管理技术减轻葡萄灰霉病的发生(中国专利，公开号CN201510374105.8，CN201310347735.7，CN201410493625.6，CN201410566149.6)；生物防治方面，主要利用蛇莓青色果实研磨液防治葡萄灰霉病(中国专利，公开号CN201410096937.3)。目前，尚未出现利用葡萄自身的内生真菌进行生物防治葡萄灰霉病的研究报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种葡萄内生真菌及其防治葡萄灰霉病的应用，该葡萄内生真菌对葡萄灰霉病防治效果好，具有重要的农业应用价值。为了实现上述任务，本专利技术采取如下的技术解决方案：一种葡萄内生真菌，其特征在于，该内生真菌命名为疣孢漆斑菌，其DNA序列是：TCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAAACTCCCAAACCCTTTGTGAACCTTACCATATTGTTGCTTCGGCGGGACCGCCCCGGCGCCTTCGGGCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGCCCCAAACTCTTATGTCTTTAGTGGTTTTCTCCTCTGAGTGACACATAAACAAATAAATAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAGGCCCCCAGTGCCTGGTGTTGGGGATCGGCCCAGCCTTCTCGCAAGGCCGCCGGCCCCGAAATCTAGTGGCGGTCTCGCTGTAGTCCTCCTCTGCGTAGTAGCACAACCTCGCAGTTGGAACGCGGCGGTGGCCATGCCGTTAAACACCCCACTTCTGAAAGTTGACCTCGGATCAGGTAGGA。上述疣孢漆斑菌是从野生山葡萄品种‘双优’上分离得到。经申请人的研究表明，上述葡萄内生真菌可以用于防治葡萄灰霉病的应用。其具体的应用是将疣孢漆斑菌制成生物防治菌剂喷施在葡萄品种上，防治效果明显。所述葡萄品种为欧洲葡萄‘红地球’品种。所述生物防治菌剂通过以下两种方法制备：(1)将疣孢漆斑菌接种在PDA培养基上培养15天，待菌落表面产生不规则黑色斑点，用无菌手术刀轻轻刮取疣状突起，溶于无菌水中，利用血球计数板计算孢子量，调整至1×106个/mL，得到生物防治菌剂；(2)将疣孢漆斑菌接种在PDA培养基上培养5天，用直径4mm的打孔器在菌落边缘打孔，每150mL查氏液体培养基接种8个菌饼，25℃下黑暗振荡培养15d，查氏液体培养基的培养液经4层纱布过滤，12000rpm离心10min，然后0.22μm过滤灭菌，得到生物防治菌剂。所述的查氏液体培养基配方为：蔗糖：30g，KNO3：2g，K2HPO4：1g，0.5gMgSO4·7H2O：0.5g，KCl：0.5g，FeSO4·7H2O：0.01g，加蒸馏水定容至1000mL。本专利技术的内生真菌通过形态鉴定和分子鉴定，确定为疣孢漆斑菌，属于半知菌类，漆斑菌属。通过对峙培养和分泌物抑制实验，发现该疣孢漆斑菌对葡萄灰霉菌具有较强的抑制作用。与现有技术相比，本专利技术具有以下技术效果：(1)该生物防治菌株疣孢漆斑菌是葡萄自身携带的内生真菌，可完全克服使用化学农药防治所带来的诸多问题，有利于葡萄无公害、绿色生产、有利于提高葡萄果实的商品性、有利于节省成本，具有潜在的应用前景。(2)对峙培养和抑菌实验都显示该生物防治菌株对葡萄灰霉菌的生长发育有较好的抑制作用，活体实验也显示菌剂喷施在葡萄品种后，防治效果明显，而且具有安全、无环境污染等优点，可应用于葡萄灰霉病的防治。附图说明图1是疣孢漆斑菌的菌落形态特征图片。其中，A图是在PDA培养皿上生长15天的菌落正面形态；B图是在PDA培养皿上生长15天的菌落反面形态；C图是在PDA培养皿上生长15天的菌丝形态，标尺为500μm；D图和E图是菌落表面的漆状黑色斑点的形态，D图标尺为1mm，E图标尺为200μm；F是疣孢漆斑菌的孢子形态，标尺为10μm。图2是疣孢漆斑菌菌剂制备图。其中，A图是孢子悬浮液；B图是疣孢漆斑菌液体培养15天的情况；C图是疣孢漆斑菌发酵液。图3是疣孢漆斑菌拮抗葡萄灰霉菌的生长图。其中，A图是葡萄灰霉菌在正常的PDA培养皿上生长4天的形态；B图是在有疣孢漆斑菌的PDA上葡萄灰霉菌生长4天的对峙情况；C图是对峙培养1个月的情况。图4是疣孢漆斑菌分泌物对葡萄灰霉本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种葡萄内生真菌，其特征在于，该内生真菌命名为疣孢漆斑菌，其DNA序列是：TCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAAACTCCCAAACCCTTTGTGAACCTTACCATATTGTTGCTTCGGCGGGACCGCCCCGGCGCCTTCGGGCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGCCCCAAACTCTTATGTCTTTAGTGGTTTTCTCCTCTGAGTGACACATAAACAAATAAATAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAGGCCCCCAGTGCCTGGTGTTGGGGATCGGCCCAGCCTTCTCGCAAGGCCGCCGGCCCCGAAATCTAGTGGCGGTCTCGCTGTAGTCCTCCTCTGCGTAGTAGCACAACCTCGCAGTTGGAACGCGGCGGTGGCCATGCCGTTAAACACCCCACTTCTGAAAGTTGACCTCGGATCAGGTAGGA。...

【技术特征摘要】
1.一种葡萄内生真菌，其特征在于，该内生真菌命名为疣孢漆斑菌，其DNA序列是：TCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAAACTCCCAAACCCTTTGTGAACCTTACCATATTGTTGCTTCGGCGGGACCGCCCCGGCGCCTTCGGGCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGCCCCAAACTCTTATGTCTTTAGTGGTTTTCTCCTCTGAGTGACACATAAACAAATAAATAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAGGCCCCCAGTGCCTGGTGTTGGGGATCGGCCCAGCCTTCTCGCAAGGCCGCCGGCCCCGAAATCTAGTGGCGGTCTCGCTGTAGTCCTCCTCTGCGTAGTAGCACAACCTCGCAGTTGGAACGCGGCGGTGGCCATGCCGTTAAACACCCCACTTCTGAAAGTTGAC...

【专利技术属性】
技术研发人员：李智，王西平，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61