一种阳离子聚合物基因载体及其制备方法和应用技术

一种阳离子聚合物基因载体，以N‑3‑氨丙基甲基丙烯酰胺和N‑(1，3‑二羟基‑2‑丙基)甲基丙烯酰胺为单体合成嵌段聚合物N‑(1，3‑二羟基‑2‑丙基)甲基丙烯酰胺‑b‑N‑3‑氨丙基甲基丙烯酰胺聚合物，随后在N‑3‑氨丙基甲基丙烯酰胺链段上偶联胍基，得到N‑(1，3‑二羟基‑2‑丙基)甲基丙烯酰胺‑b‑N‑3‑胍丙基甲基丙烯酰胺聚合物；或者接枝具有肿瘤靶向性的甲硫氨酸并将伯氨基胍基化，得到N‑(1，3‑二羟基‑2‑丙基)甲基丙烯酰胺‑b‑(N‑3‑氨丙基甲基丙烯酰胺‑g‑甲硫氨酸)‑b‑胍丙基甲基丙烯酰胺聚合物。本发明专利技术还提出了上述基因载体的制备方法。本发明专利技术的基因载体可以携带基因药物且具有良好的生物相容性和肿瘤靶向性，应用前景大。

Cationic polymer gene carrier, preparation method and application thereof

A cationic polymer gene carrier with N 3 aminopropyl methyl acrylamide and N (1, 3 two hydroxy 2 methyl propyl) acrylamide N triblock copolymer monomers (1, 3 two hydroxy 2 propyl methacrylamide) B N 3 ammonia allyl methyl acrylamide polymer, followed by N 3 aminopropyl methyl acrylamide chain coupling N guanidine, (1, 3 two hydroxy 2 propyl methacrylamide) B N 3 guanidine propyl methyl acrylamide polymer; graft or with tumor targeting methionine. The primary amino guanidine, N (1, 3 two hydroxy 2 propyl methacrylamide (b) N 3 aminopropyl methyl acrylamide g methionine) B guanidine propyl methyl acrylamide polymer. The invention also provides a preparation method of the gene carrier. The gene vector of the invention can carry gene medicine, and has good biocompatibility and tumor targeting property, and has great application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一种阳离子聚合物基因载体及其制备方法和应用
本专利技术属于医药领域，具体涉及一种阳离子聚合物基因载体及其制备方法和应用。
技术介绍
阳离子聚合物是一类新型非病毒基因载体，其具有病毒类基因载体所没有的良好的物理化学性质、高度的分子多样性、低免疫原性、结构易于修饰、携带基因大小和类型不受限制等优点[1]。聚乙烯亚胺(PEI)是目前应用最为广泛的阳离聚合物基因载体，1995年，Boussif等首次报道了PEI可作为阳离子聚合物基因载体携带含有负电的DNA分子形成PEI/DNA复合物[2]。这种PEI/DNA复合物进入细胞的溶酶体后，PEI分子链上的氮原子被质子化，使溶酶体pH升高，引起Cl离子内流，从而使得复合物从溶酶体中逃逸出来，DNA得到表达。而N-3-氨丙基甲基丙烯酰胺(APMA)是具有伯胺基残基的单体，该单体合成的均聚物载体在基因递送研究中显示了较高的转染效果[3]。N-(1，3-二羟基-2-丙基)甲基丙烯酰胺(DHPMA)是一类亲水性良好的单体，其均聚物作为聚合物载体的亲水性链段，使DHPMA对阳离子聚合物的正电荷掩蔽作用及血液中蛋白沉积的抑制作用更强，可大大降低聚合物毒性[4，5]。此外，DHPMA作为人工聚合物，分子量范围很宽，选择的自由度高[6]。聚合物骨架具有亲水性链段，使其具有舒展的分子结构，并对其本身的正电荷进行适当保护，提高载体在靶细胞外的稳定性能，减少细胞毒性[7，8]。1988年，Green等证实人免疫缺损病毒HIV-1的反式激活蛋白Tat蛋白、果蝇触角足转录因子ANTP的同源异构结构域、单纯疱疹病毒1型VP22转录因子等都具有强大的细胞膜穿透能力。[9-11]人们把这类具有细胞膜穿透能力的短肽称为细胞穿透肽(CellPenetratingPeptides，CPPs)。研究结果表明，精氨酸能有效转运穿透细胞膜，在细胞穿透过程中扮演非常重要的角色，研究推测精氨酸中的胍基是赋予此类物质细胞膜穿透能力的功能部分。[12]有效地触发基因沉默是RNA干扰技术(RNAi)成功应用的关键。RNAi始于Dicer酶。作为RNaseIII家族的Dicer酶剪切dsRNA生成19-21个核苷酸的小干扰RNA(siRNA)片段[13-15]。这些siRNA可选择性地沉默目的信使RNA(mRNA)[16-18]。尽管在体外细胞培养和动物体内研究中，siRNA显示出对目标基因的良好抑制效果。siRNA在临床应用方面面临着许多障碍，如较弱的细胞膜穿透能力，无靶向性，且在生理环境中不稳定。因此如何增强siRNA在体内的稳定性和穿透细胞膜的能力，增强其细胞和组织靶向性等都是急切需要解决的问题。因此，开发相应的载体成为发展占和实施RNAi的关键。病毒载体生产成本高，进入体内后具有诸多缺点(如无靶向性、产生免疫原性等)，这些因素限制了其实际使用[19]。1999年，美国出现首例因使用腺病毒载体而导致病人死亡的事件，这加快了研究者对于非病毒型基因载体的开发。[20]基于高分子材料的非病毒载体已经广泛用于对siRNA分子的传递，其中很多成果进入临床试验阶段。高分子载体具有较好的生物相容性和靶向传递的潜力，能有效提高生物活性分子在生理环境中的稳定性。高分子基因载体在系统给药后会产生EPR效应(Enhancedpermeabilityandretention)，进而促进其在肿瘤组织的富集。[21]本专利技术提供高分子载体具有高效的转染能力，能有效负载疏水药物并保护siRNA分子，实现靶向治疗的同时干扰目的基因表达，达到协同治疗效果，具有良好的优势和应用前景。参考文献[1]LaresMR，RossiJJ，OuelletDL.RNAiandsmallinterferingRNAsinhumandiseasetherapeuticapplications.Trendsinbiotechnology.2010；28：570-9.[2]BoussifO，Lezoualc′hF，ZantaMA，MergnyMD，SchermanD，DemeneixB，etal.Aversatilevectorforgeneandoligonucleotidetransferintocellsincultureandinvivo：polyethylenimine.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences.1995；92：7297-301.[3]YorkAW，ZhangY，HolleyAC，GuoY，HuangF，McCormickCL..FacileSynthesisofMultivalentFolate-BlockCopolymerConjugatesviaAqueousRAFTPolymerization：TargetedDeliveryofsiRNAandSubsequentGeneSuppression.Biomacromolecules.2009；10：936-43.[4]LuoD，HaverstickK，BelchevaN，HanE，SaltzmanWM.Poly(ethyleneglycol)-conjugatedPAMAMdendrimerforbiocompatible，high-efficiencyDNAdelivery.Macromolecules.2002；35∶3456-62.[5]KichlerA，ChillonM，LeborgneC，DanosO，FrischB.Intranasalgenedeliverywithapolyethylenimine-PEGconjugate.JControlRelease.2002；81：379-88.[6]ItakaK，YamauchiK，HaradaA，NakamuraK，KawaguchiH，KataokaK.PolyioncomplexmicellesfromplasmidDNAandpoly(ethyleneglycol)-poly(-lysine)blockcopolymerasserum-tolerablepolyplexsystem：physicochemicalpropertiesofmicellesrelevanttogenetransfectionefficiency.Biomaterials.2003；24∶4495-506.[7]LiSD，HuangL..TargeteddeliveryofantisenseoligodeoxynucleotideandsmallinterferenceRNAintolungcancercells.MolPharmaceut.2006；3∶579-88.[8]deWolfHK，SnelCJ，VerbaanFJ，SchiffelersRM，HenninkWE，StormG..Effectofcationiccarriersonthepharmacokineticsandtumorlocalizationofnucleicacidsafterintravenousadministration.InternationalJournalofPharmaceutics.2007；331：1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种阳离子聚合物基因载体，其特征在于，该基因载体以N‑3‑氨丙基甲基丙烯酰胺和N‑(1，3‑二羟基‑2‑丙基)甲基丙烯酰胺为单体，采用可逆加成断裂链转移聚合法合成嵌段聚合物N‑(1，3‑二羟基‑2‑丙基)甲基丙烯酰胺‑b‑N‑3‑氨丙基甲基丙烯酰胺聚合物，随后在N‑3‑氨丙基甲基丙烯酰胺链段上偶联胍基基团，得到N‑(1，3‑二羟基‑2‑丙基)甲基丙烯酰胺‑b‑N‑3‑胍丙基甲基丙烯酰胺聚合物；或者在N‑3‑氨丙基甲基丙烯酰胺链段上接枝甲硫氨酸并偶联胍基基团，得到N‑(1，3‑二羟基‑2‑丙基)甲基丙烯酰胺‑b‑(N‑3‑氨丙基甲基丙烯酰胺‑g‑甲硫氨酸)‑b‑N‑3‑胍丙基甲基丙烯酰胺聚合物，其中，N‑3‑氨丙基甲基丙烯酰胺链段在聚合物中的摩尔百分比为17％～56％。

【技术特征摘要】
2016.03.29 CN 20161018866631.一种阳离子聚合物基因载体，其特征在于，该基因载体以N-3-氨丙基甲基丙烯酰胺和N-(1，3-二羟基-2-丙基)甲基丙烯酰胺为单体，采用可逆加成断裂链转移聚合法合成嵌段聚合物N-(1，3-二羟基-2-丙基)甲基丙烯酰胺-b-N-3-氨丙基甲基丙烯酰胺聚合物，随后在N-3-氨丙基甲基丙烯酰胺链段上偶联胍基基团，得到N-(1，3-二羟基-2-丙基)甲基丙烯酰胺-b-N-3-胍丙基甲基丙烯酰胺聚合物；或者在N-3-氨丙基甲基丙烯酰胺链段上接枝甲硫氨酸并偶联胍基基团，得到N-(1，3-二羟基-2-丙基)甲基丙烯酰胺-b-(N-3-氨丙基甲基丙烯酰胺-g-甲硫氨酸)-b-N-3-胍丙基甲基丙烯酰胺聚合物，其中，N-3-氨丙基甲基丙烯酰胺链段在聚合物中的摩尔百分比为17％～56％。2.根据权利要求1所述的阳离子聚合物基因载体，其特征在于，所述的阳离子聚合物基因载体的数均分子量为16400～45700g/mol。3.根据权利要求1所述的阳离子聚合物基因载体，其特征在于，所述的阳离子聚合物基因载体的主链中N-3-氨丙基甲基丙烯酰胺的聚合度为10-90，N-(1，3-二羟基-2-丙基)甲基丙烯酰胺聚合度为10-90。4.根据权利要求1所述的阳离子聚合物基因载体，其特征在于，所述的阳离子聚合物基因载体为N-(1，3-二羟基-2-丙基)甲基丙烯酰胺-b-(N-3-氨丙基甲基丙烯酰胺-g-甲硫氨酸)-b-胍丙基甲基丙烯酰胺聚合物，数均分子量为16400～19100g/mol。5.权利要求1所述的阳离子聚合物基因载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)DHPMA聚合物的制备：取二硫代苯甲酸(4-氰基戊酸)酯和ACVA溶于1，4-二氧六环中，得到溶液A，然后将溶液A和DHPMA的水溶液加入到聚合瓶中，通氮气1～2h，蜡封聚合瓶，然后将聚合瓶放入预热至70～80℃的油浴中反应12～24h，将聚合瓶取出，冷却，终止聚合反应，将得到的产物加入到冰丙酮中沉淀，离心，反复溶解、沉淀若干次，最后将产物置于真空干燥箱50～60℃干燥得产物DHPMA聚合物，记为PDHPMA；(2)DHPMA-b-APMA聚合物的制备：将PDHPMA和APMA单体溶于蒸馏水中，得到溶液B，将溶液B和ACVA的二氧六环溶液混合均匀后转移至聚合瓶中，体系用干燥氮气通气1～2h，蜡封聚合瓶，将聚合瓶放入预热至70℃～80℃油浴中反应12～24h，反应结束后将聚合瓶取出，冷却，终止聚合反应，产物加入到预冷的丙酮中沉淀，离心，反复溶解、沉淀若干次，然后将得到的产物置于真空干燥箱50～60℃干燥得到DHPMA-b-APMA聚合物，记为DA聚合物；(3)胍基化DA聚合物的合成：将步骤(2)中制备的DHPMA-b-APMA聚合物溶于水中，随后加入胍基化试剂，调节反应溶液pH至8～10，室温下反应12～24h，用超纯水离心洗涤，冷冻干燥得到产物N-(1，3-二羟基-2-丙基)甲基丙烯酰胺-b-N-3-胍丙基甲基丙烯酰胺聚合物，记为DHPMA-b-GPMA或DG；进一步地(4)甲硫氨酸接枝的DG聚合物的制备：取甲硫氨酸溶于0.2M磷酸盐缓冲溶液PBS中，随后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，调节反应溶液pH至5.5-6.5，室温反应15～30min，加入2-巯基乙醇终止反应；将步骤(3)中制备的DG聚合物溶于0.2MPBS缓冲液中并加入到上述反应液中，调节溶液pH至7-8，室温反应2h；将反应液用超纯水离心洗涤，制得N-(1，3-二...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴旸，唐金海，吴建中，马蓉，张薇，孙春龙，
申请(专利权)人：江苏省肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32