荧光定量RT‑PCR检测大鼠疑似泰勒氏病毒的引物对、探针、试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种荧光定量RT‑PCR检测大鼠疑似泰勒氏病毒的引物对、探针、试剂盒及方法，所述检测方法是以大鼠的脑组织的cDNA为模板，SEQ ID No:1和SEQ ID No:2为引物，SEQ ID No:3为探针，进行荧光定量PCR扩增，采集荧光信号。本发明专利技术的荧光定量RT‑PCR检测方法可以实现快速、准确、方便快捷、特异性地针对大鼠疑似泰勒氏病毒核酸进行检测，灵敏度高、特异性强、重复性好，具有广阔的应用前景。

Fluorescence quantitative RT detection of PCR rats suspected Taylor virus primer, probe and kit and method

The invention discloses a fluorescence quantitative RT detection of PCR rats suspected Taylor virus primer, probe and kit and method, the detection method is based on the rat brain tissue cDNA as template, SEQ ID and SEQ No:1 ID No:2 as primer, SEQ ID No:3 probe for PCR amplification and fluorescence signal acquisition. PCR fluorescence quantitative RT detection method of the invention can realize fast, accurate, convenient, specific for rat Taylor suspected viral nucleic acid detection, high sensitivity, strong specificity and good repeatability, and has broad application prospects.

【技术实现步骤摘要】
荧光定量RT-PCR检测大鼠疑似泰勒氏病毒的引物对、探针、试剂盒及方法
本专利技术属于生物工程
，尤其涉及一种荧光定量RT-PCR检测大鼠疑似泰勒氏病毒的引物对、探针、试剂盒及方法。
技术介绍
大鼠疑似泰勒氏病毒(RatTheiler's-likevirus,TLV)，TLV属于小RNA病毒科心病毒属成员，代表株为NGS910，基因组大小为8.021kb。其L基因的开放性阅读框(ORF)与泰勒氏鼠脑脊髓炎病毒(Theiler’smurineencephalomyelitisvirus,TMEV)有72％同源，与脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditisvirus,EMCV)同源性为55％～56％。TLV主要侵害大鼠中枢神经系统，多数呈隐性感染，有时表现脑脊髓炎、脑膜炎和后肢麻痹等症状。一旦污染了TLV，将会对实验大鼠及其生物技术产品造成巨大的经济损失。巴西JCJo等1995-2012年收集的样品中TLV抗体阳性率为9％，为第二常见病毒。2000-2003年的检测数据显示：TLV阳性率在2.3％，仅次于细小病毒。王翠娥等(2014)利用血清学检测和免疫荧光试验(IFA)发现：国标SPF登记要求检测范围以外的TLV、K病毒、大鼠呼吸道病毒(RRV)等出现阳性。有此可见，TLV是非常重要的待检病原。在国内该病的研究亦几乎处于空白。目前，国际上常用的TLV检测方法是血清学检测，其中大鼠的采血，血清分离都是特别繁琐和耗时，且现如今市场上有的大鼠疑似泰勒氏病毒感染检测ELISA试剂盒，大部分为进口试剂盒，价格都在2000-3000元左右，而且仅可以检测96乘以2个样。因此，传统的方法存在着繁琐、局限性、灵敏度低、价格高等不足，急需开发一种简便、快速、准确检测TLV的方法和试剂盒产品。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种荧光定量RT-PCR检测大鼠疑似泰勒氏病毒的引物对、探针、试剂盒及方法，该试剂盒及方法能快速、准确、灵敏、特异地对TLV病毒进行检测。为了解决上述技术问题，本专利技术通过如下技术方案实现:在本专利技术的一个方面，提供了一种荧光定量RT-PCR检测大鼠疑似泰勒氏病毒的引物对，所述引物对具有如SEQIDNo:1和SEQIDNo:2所示的碱基序列。在本专利技术的另一方面，还提供了一种荧光定量RT-PCR检测大鼠疑似泰勒氏病毒的探针，所述探针具有如SEQIDNo:3所示的碱基序列。优选的，所述探针的5’结合有FAM，所述探针的3’结合有BHQ1。在本专利技术的另一方面，还提供了一种荧光定量RT-PCR检测大鼠疑似泰勒氏病毒的试剂盒，所述试剂盒包括如SEQIDNo:1和SEQIDNo:2所示的引物对、以及SEQIDNo:3所示的探针。优选的，所述试剂盒还包括：含有大鼠疑似泰勒氏病毒TLVNGS910毒株SEQIDNo:4所示部分基因序列的阳性重组质粒标准品。在本专利技术的另一方面，还提供了一种荧光定量RT-PCR检测大鼠疑似泰勒氏病毒的方法，包括以下步骤：以大鼠脑组织的cDNA为模板，SEQIDNo:1和SEQIDNo:2为引物，SEQIDNo:3为探针，进行荧光定量PCR扩增，采集荧光信号。在其中一些实施例中，所述荧光定量PCR扩增的反应体系为：PremixExTaq10μL、ROXReferenceDyeII0.2μL、cDNA模板2μL、SEQIDNo:1引物0.4μL、SEQIDNo:2引物0.4μL、SEQIDNo:3探针0.8μL、加灭菌蒸馏水至20μL。在其中一些实施例中，所述荧光定量PCR扩增的反应条件为：95℃预变性30sec；95℃变性5sec，60℃退火延伸34sec，40个循环。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：1、本专利技术通过设计出特异性的引物对和探针，优化荧光定量RT-PCR检测方法的反应条件，从而快速、准确、特异性地针对大鼠疑似泰勒氏病毒(TLV)进行检测，不仅可以实现对实验大鼠的大样本筛查，也可以对细胞系和生物原材料进行外源因子检测；2、本专利技术的荧光定量RT-PCR检测方法只需收集能提取到微量的cDNA的组织即可，且仅需要合成引物对，探针，便可方便快捷的检测几千个样本，便捷廉价；3、本专利技术的荧光定量RT-PCR检测方法的最低可检测模板浓度为30拷贝/μL，约100fgDNA，比常规的PCR方法高出近100倍，其它常见的大鼠病毒株均无特异性扩增，没发现交叉反应，批内和批间变异系数均小于1％，说明本专利技术的检测方法和试剂盒灵敏度高、特异性强、重复性好，具有广阔的应用前景。附图说明下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细的说明。图1是本专利技术实施例1的普通PCR检测结果图；图2是本专利技术实施例1的TLVTaqMan荧光定量PCR检测方法的标准曲线和熔点曲线图；图3是本专利技术实施例2的TLVTaqMan探针qPCR动力学曲线图；图4是本专利技术实施例3的TLVTaqman荧光定量PCR检测方法的特异性结果图；图5是本专利技术实施例4临床样品检测结果图。具体实施方式下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》(萨姆布鲁克J，拉塞尔DW，著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译.分子克隆实验指南，第3版，北京：科学出版社，2002)中所述的方法进行。实施例1大鼠疑似泰勒氏病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立1.引物和探针的设计根据大鼠疑似泰勒氏病毒TLVNGS910毒株的全基因组序列(Genbank登录号为：AB090161.1)，选取3622～3729nt这一段特异区域序列：ggctttggatacaagggaacacttcagtggctgtgagagttaggtataagaaaatgaaagttttctgtccccgtcccactctcttccttccttggccctcgaccaccactaccagaatccatgcagataacccagtgt(SEQIDNO：4)。与pUC57载体连接，构建TLV的质粒标准品。在3622～3729nt处设计引物和TaqMan特异性探针：qTLV-F:5’-CTTCAGTGGCTGTGAGAGTTAG-3’(SEQIDNO：1)；qTLV-R:5’-ATCTGCATGGATTCTGGTAGTG-3’(SEQIDNO：2)；FAM-TLV:5’-FAM-CCGTCCCACTCTCTTCCTTCCTTG-3’-BHQ1(SEQIDNO：3)。2.pUC-TLV108质粒合成及普通PCR结果送GENEWIZ公司合成获得的pUC-TLV108质粒，以10倍倍比稀释，最终浓度分别在3×106～3×100拷贝数/μL，利用qTLV-F和qTLV-R引物PCR扩增，结果如图1所示，普通PCR最低可以检测到3×103拷贝数/μL。图1中，1-6号孔：模板浓度依次为3×106、3×105、3×104、3×103、3×102、3×101拷贝数。3.荧光定量PCR反应体系荧光定量PCR扩增反应总体系为20μL，其中：PremixExTaq(ProbeqPCR)(2×)使用量为10μL，ROXReferenceDyeII(50×)使用量为0.2μL，模板使用量2μL，qTLV-F、qTLV-R上、下游引物(10μmol/L)各0本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种荧光定量RT‑PCR检测大鼠疑似泰勒氏病毒的引物对，其特征在于，所述引物对具有如SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的碱基序列。

【技术特征摘要】
1.一种荧光定量RT-PCR检测大鼠疑似泰勒氏病毒的引物对，其特征在于，所述引物对具有如SEQIDNo:1和SEQIDNo:2所示的碱基序列。2.一种荧光定量RT-PCR检测大鼠疑似泰勒氏病毒的探针，其特征在于，所述探针具有如SEQIDNo:3所示的碱基序列。3.根据权利要求2所述的荧光定量RT-PCR检测大鼠疑似泰勒氏病毒的探针，其特征在于，所述探针的5’结合有FAM，所述探针的3’结合有BHQ1。4.一种荧光定量RT-PCR检测大鼠疑似泰勒氏病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的引物对、以及权利要求2或3所述的探针。5.根据权利要求4所述的荧光定量RT-PCR检测大鼠疑似泰勒氏病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：含有大鼠疑似泰勒氏病毒TLVNGS910毒株SEQIDNo:4所示部分基因序列的阳性重组质粒标准品。6.一种荧...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏晓锋，蔡骁垚，熊炜，胡建华，张泉，其他发明人请求不公开姓名，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所，
类型：发明
国别省市：上海,31