一种检测革兰氏阳性细菌耐药基因的基因芯片试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种检测革兰氏阳性细菌耐药基因的基因芯片试剂盒。本发明专利技术所提供的试剂盒中含有用于检测革兰氏阳性细菌耐药基因的引物对组，由3个引物对组成，其序列为序列表中序列1-6；同时所述试剂盒中还含有固定有序列7-9所示3个单链DNA探针的杂交芯片。本发明专利技术提供的试剂盒支持高通量、快速、准确地检测多个革兰氏阳性细菌耐药基因，对中国人群进行筛查，能有效地起到准确诊断、耐药溯源、耐药控制等作用，从而抗生素使用量，减少耐药产生。

Gene chip kit for detecting gram positive bacteria resistance genes

The invention discloses a gene chip kit for detecting gram positive bacteria resistance genes. The kit provided by the invention contains for gram positive bacteria resistant gene detection primer pairs, by 3 primer pairs. The sequence of the sequence in the sequence table 1-6; at the same time the kit also contains a fixed sequence of 7-9 shows 3 single stranded DNA probe hybridization chip. The kit provided by the invention supports high-throughput, rapid and accurate detection of multiple gram positive bacteria resistant gene, screening for Chinese people, can effectively play the accurate diagnosis and drug resistance, resistance control traceability, and the usage of antibiotics, reducing the resistance of production.

【技术实现步骤摘要】
一种检测革兰氏阳性细菌耐药基因的基因芯片试剂盒
本专利技术属于核酸扩增
，涉及一种检测革兰氏阳性细菌耐药基因的基因芯片试剂盒。
技术介绍
细菌耐药基因检测具有重要临床意义。临床诊断中存在抗生素的用量大、起点高、种类较为随意的缺陷，从而导致耐药菌种的产生和流行。目前用于耐药基因检测仍较为传统，大致有生理生化试验、血清学试验、药敏试验等后加以聚合酶链式反应(PCR)扩增相应基因的方法，而上述检测方法需要时间长，方法操作烦琐、报告结果慢、通量低，且往往先鉴定出菌种，才能相应的进行药敏等后续试验，因而难以适应临床治疗的需要。因此开发快速高通量的分子诊断技术检测，可以协助快速诊断，指导及时准确用药。生物芯片技术是近年来在生命科学领域中迅速发展并成熟的一项高新技术，主要是通过微加工技术和微电子技术在固相芯片表面构建的微型生物化学分析系统，可实现对细胞、蛋白质、核酸以及其他多种生物成份的准确、快速、大量信息的检测。生物芯片的主要特点是高通量、微型化和自动化。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种用于检测革兰氏阳性细菌耐药基因的引物对组。本专利技术所提供的用于检测革兰氏阳性细菌耐药基因的引物对组，由如下3个引物对组成：1)如下(a1)或(a2)所示的引物对，记为引物对1：(a1)由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对；(a2)由将序列表中序列1和序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条单链DNA分子组成的，且与(a1)中所述引物对功能相同的引物对；2)如下(b1)或(b2)所示的引物对，记为引物对2：(b1)由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA分子组成的引物对；(b2)由将序列表中序列3和序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条单链DNA分子组成的，且与(b1)中所述引物对功能相同的引物对；3)如下(c1)或(c2)所示的引物对，记为引物对3：(c1)由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA分子组成的引物对；(c2)由将序列表中序列5和序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条单链DNA分子组成的，且与(c1)中所述引物对功能相同的引物对。其中，所述引物对1用于扩增mecA基因；所述引物对2用于扩增vanA基因；所述引物对3用于扩增vanB基因。本专利技术的第二个目的是提供一种用于检测革兰氏阳性细菌耐药基因的成套单链DNA。本专利技术所提供的用于检测细菌耐药基因的成套单链DNA，具体由探针组和所述引物对组组成；所述探针组由如下3个单链DNA探针组成：序列表中序列7所示的单链DNA探针1；序列表中序列8所示的单链DNA探针2；序列表中序列9所示的单链DNA探针3。其中，所述单链DNA探针1用于检测所述引物对1的扩增结果；所述单链DNA探针2用于检测所述引物对2的扩增结果；所述单链DNA探针3用于检测所述引物对3的扩增结果。本专利技术的第三个目的是提供一种用于检测革兰氏阳性细菌耐药基因的试剂盒。本专利技术所提供的用于检测革兰氏阳性细菌耐药基因的试剂盒，含有所述引物对组，以及杂交芯片；所述杂交芯片是按照包括如下步骤的方法制备获得的：将通式为“NH2-(T)n-杂交探针序列”的3种单链检测探针分别通过氨基与醛基的反应固定到醛基修饰化的固相载体(如玻片)上，获得所述杂交芯片；所述通式中的(T)n表示n个连续的T，n为大于等于5，且小于等于30的整数；所述通式中对应于所述3种单链检测探针的3种杂交探针序列分别如序列表中序列7-9所示。根据需要，所述试剂盒中还可含有经荧光标记的随机引物；所述随机引物的序列为5’-NX-3’，N表示A、G、C和T中的任一种，6≤X≤15，且X为整数(如X＝9)，NX表示X个连续的脱氧核糖核苷酸。以上所述经荧光标记的随机引物是用于对所述引物对组中的引物对的扩增产物进行荧光标记的。根据需要，也可以不采用所述经荧光标记的随机引物对扩增产物进行荧光标记，而是采用其他方法。如将所述引物对组中每个引物对的一条引物的5’末端进行荧光标记(如TAMRA)，被荧光标记的引物是存在于扩增产物中可被相应探针杂交的单链DNA上的引物。所述试剂盒中还可含有杂交液；所述杂交液中含有经荧光标记的无关单链DNA分子；所述无关单链DNA分子为非源自于所述细菌耐药基因的单链DNA分子。所述杂交芯片的制备方法还包括将表面化学质控探针QC、和/或杂交质控探针PC、和/或阴性对照探针BC通过氨基与醛基的反应固定到所述醛基修饰化的固相载体(如玻片)上的步骤；所述表面化学质控探针QC、所述杂交质控探针PC和所述阴性对照探针均为单链探针；所述表面化学质控探针QC的一端经氨基修饰，另一端具有荧光标记(如Hex)；所述杂交质控探针PC的一端经氨基修饰，且能与所述杂交液中的所述无关单链DNA分子杂交；所述阴性对照探针BC的一端经氨基修饰，且与源自于所述革兰氏阳性细菌耐药基因的任何单链DNA分子均不能杂交。进一步，在本专利技术中，所述表面化学质控探针QC自5’端到3’端的结构组成为“NH2-TCACTTGCTTCCGTTGAGG-Hex”；所述杂交质控探针PC自5’端到3’端的结构组成为“NH2-TTTTTTTTTTTTCCTCAACGGAAGCAAGTGAT”；所述阴性对照探针BC自5’端到3’端的结构组成为“NH2-TTTTTTTTTTTTGTTGCTTCTGGAATGAGTTTGCT”。所述引物对组或所述成套单链DNA或所述试剂盒在如下(a)或(b)中的应用也属于本专利技术的保护范围：(a)检测或辅助检测革兰氏阳性细菌耐药基因(非诊断目的)，或制备用于检测或辅助检测革兰氏阳性细菌耐药基因的产品；(b)检测或辅助检测含有革兰氏阳性细菌耐药基因的细菌(非诊断目的)，或制备用于检测或辅助检测含有革兰氏阳性细菌耐药基因的细菌的产品。在本专利技术中，所述革兰氏阳性细菌耐药基因具体可为如下中的至少一种：mecA基因、vanA基因、vanB基因。所述mecA基因的GenBank登录号为AB221119.1(update：2006-5-19)；所述vanA基因的GenBank登录号为M97297.1(update：2002-6-20)；所述vanB基因的GenBank登录号为AY655711.1(update：2005-11-7)。相应的，含有所述mecA基因的细菌具体可为金黄色葡萄球菌；含有所述vanA基因的细菌具体可为粪肠球菌或屎肠球菌；含有所述vanB基因的细菌具体可为粪肠球菌或屎肠球菌。所述引物对组或所述成套单链DNA在制备所述试剂盒中的应用也属于本专利技术的保护范围。本专利技术对极大样本量的革兰氏阳性细菌耐药基因进行研究。本专利技术提供的试剂盒支持高通量，快速、准确地检测多个革兰氏阳性细菌耐药基因，对中国人群进行筛查，能有效地起到准确诊断、耐药溯源、耐药控制等作用，从而抗生素使用量，减少耐药产生。附图说明图1为杂交芯片的点阵排布示意图(即芯片探针布局示意图)。-表示没有固定任何探针。图2为用于检测革兰氏阳性细菌耐药基因的试剂盒的特异性分析结果。该图对应的芯片探针布局示意图如图1所示。其中，A所示芯片检测结果对应的参考品DNA质粒为ZL-v本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测革兰氏阳性细菌耐药基因的引物对组，由如下3个引物对组成：1)如下(a1)或(a2)所示的引物对，记为引物对1：(a1)由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对；(a2)由将序列表中序列1和序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条单链DNA分子组成的，且与(a1)中所述引物对功能相同的引物对；2)如下(b1)或(b2)所示的引物对，记为引物对2：(b1)由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA分子组成的引物对；(b2)由将序列表中序列3和序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条单链DNA分子组成的，且与(b1)中所述引物对功能相同的引物对；3)如下(c1)或(c2)所示的引物对，记为引物对3：(c1)由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA分子组成的引物对；(c2)由将序列表中序列5和序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条单链DNA分子组成的，且与(c1)中所述引物对功能相同的引物对。

【技术特征摘要】
1.用于检测革兰氏阳性细菌耐药基因的引物对组，由如下3个引物对组成：1)如下(a1)或(a2)所示的引物对，记为引物对1：(a1)由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对；(a2)由将序列表中序列1和序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条单链DNA分子组成的，且与(a1)中所述引物对功能相同的引物对；2)如下(b1)或(b2)所示的引物对，记为引物对2：(b1)由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA分子组成的引物对；(b2)由将序列表中序列3和序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条单链DNA分子组成的，且与(b1)中所述引物对功能相同的引物对；3)如下(c1)或(c2)所示的引物对，记为引物对3：(c1)由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA分子组成的引物对；(c2)由将序列表中序列5和序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条单链DNA分子组成的，且与(c1)中所述引物对功能相同的引物对。2.用于检测革兰氏阳性细菌耐药基因的成套单链DNA，由探针组和权利要求1所述的引物对组组成；所述探针组由如下3个单链DNA探针组成：序列表中序列7所示的单链DNA探针1；序列表中序列8所示的单链DNA探针2；序列表中序列9所示的单链DNA探针3。3.用于检测革兰氏阳性细菌耐药基因的试剂盒，含有权利要求1所述的引物对组，以及杂交芯片；所述杂交芯片是按照包括如下步骤的方法制备获得的：将通式为“NH2-(T)n-杂交探针序列”的3种单链检测探针分别通过氨基与醛基的反应固定到醛基修饰化的固相载体上，获得所述杂交芯片；所述通式中的(T)n表示n个连续的T，n为大于等于5，且小于等于30的整数；所述通式中对应于所述3种单链检测探针的3种杂交探针序列分别如序列表中序列7-9所示。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有经荧光标记的随机引物；所述随机引物的序列为5’-NX-3’，N表示A、G、C和T中的任一种，6≤X≤15，且X为整数，NX表...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜可伟，王杉，王辉，
申请(专利权)人：北京大学人民医院，
类型：发明
国别省市：北京,11