一种降低蛋白质含量的玻璃酸钠的二次解离制备方法技术

本发明专利技术提供了一种降低蛋白质含量的玻璃酸钠的二次解离制备方法，所述方法包括以下步骤：向鸡冠酶解液中加入CTAC进行沉淀络合反应至完全沉淀，得到沉淀物；向沉淀物中加入洗涤剂进行洗涤，得到洗涤后沉淀物；向洗涤后沉淀物中加入解离液氯化钠溶液进行解离，搅拌至无颗粒物，得到解离后药液；向解离后药液中加入稀释剂进行稀释至沉淀完全，得到玻璃酸钠沉淀物；向玻璃酸钠沉淀物中加入洗涤剂进行洗涤，得到洗涤后的玻璃酸钠沉淀物；向洗涤后的玻璃酸钠沉淀物中加入解离液进行解离，搅拌至溶液中无颗粒物，经过后处理得到玻璃酸钠。本发明专利技术减少了多次络合过程中的工艺时间，节约了成本；同进进一步降低的玻璃酸钠中的蛋白质及核酸含量。

Two time dissociation preparation method of sodium hyaluronate for reducing protein content

The present invention provides two dissociation preparation method to reduce protein content of sodium hyaluronate, the method comprises the following steps: to comb CTAC enzymolysis liquid were added to precipitate precipitation and complexation reaction, obtained precipitate; add detergent for washing to precipitate, obtained after washing the precipitate; adding dissociation liquid Sodium Chloride Solution to precipitate after washing to dissociate and stir until no particles, obtained after dissociation liquid; adding diluent to liquid was diluted to dissociation after complete precipitation, by sodium hyaluronate precipitate; add detergent to precipitate sodium hyaluronate for washing, get the sodium hyaluronate precipitate after washing; adding dissociation liquid to glass after washing the precipitate of sodium in dissociation, mixing with particles in solution, obtained after postprocessing of sodium hyaluronate. The invention reduces the process time in the process of multi complexing, saves the cost, and increases the content of protein and nucleic acid in sodium hyaluronate which is further decreased.

【技术实现步骤摘要】
一种降低蛋白质含量的玻璃酸钠的二次解离制备方法
本专利技术属于生物医药领域，涉及一种降低蛋白质含量的玻璃酸钠的二次解离制备方法，尤其涉及一种生物提取法制备蛋白质含量较低的玻璃酸钠的二次解离方法。
技术介绍
玻璃酸(HyaluronicAcid，简称HA)是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄糖胺双糖单位反复交替而形成的一种均聚物，其重均分子量一般为10万～1000万Da；玻璃酸钠(SodiumHyaluronate)为玻璃酸的钠盐形式，不同分子量的玻璃酸钠具有不同的生物活性。玻璃酸的结构非常规则，相同的双糖单位为HA的基本结构单元，不同动物组织和细菌来源的HA无种属差异，对人类及动物无抗原性。玻璃酸钠的蛋白质和核酸等杂质是导致其致炎症性的主要原因。因此，如何制备纯度较高的玻璃酸钠是研究重点，尤其是在生物分离纯化
，寻求生物物质的分离纯化的新技术新方法，减少杂质含量成为业界关注的重点。传统的玻璃酸钠生物提取工艺生产出的玻璃酸钠的蛋白质含量一般在0.40wt％～0.80wt％之间，为了降低蛋白质工艺，一般采用多次络合解离的方法。但是，此工艺中玻璃酸钠的复溶液稀释沉淀的工艺时间太长，造成大量工艺时间和能耗的浪费；同时，其蛋白质的降低量仍有一定的区间。CN102516408A公开了一种玻璃酸钠的纯化方法，该方法首先将鸡冠酶解液经活性炭一次吸附过滤后，所得滤液与CPC水溶液搅拌混匀，络合沉淀完全后，将沉淀静置，弃去上清液，用解离液将络合沉淀搅拌解离；解离后的液体通过稀释至其体积的2～8倍，进行二次络合沉淀，络合沉淀完毕后弃去上清液，将沉淀洗涤1～3次后，用解离液将络合沉淀搅拌解离；第二次解离后的液体用活性炭吸附后除碳过滤，滤液用醇沉淀出来的玻璃酸钠，脱水，抽真空。CN104610466A公开了一种生物提取法制备玻璃酸钠中降低蛋白质含量的方法，所述方法是在CPC沉淀解离后，向解离液中加入纯化水，稀释解离液离子强度，通过季铵盐络合沉淀解离的原理：在低盐浓度下季铵基上阳离子游离出来，与黏多糖分子上的阴离子结合形成季铵络合物，在高盐浓度下络合物逐渐解离。通过这一可逆反应，从而使解离液中的沉淀重新络合，再经漂洗、二次解离、过滤、醇沉、干燥。然而上述现有技术中复溶液稀释沉淀的工艺时间太长，且玻璃酸钠中蛋白质含量仍然较高，并且玻璃酸钠的收率较低，仅可达到千分之几的水平。
技术实现思路
针对现有技术中复溶液稀释沉淀的工艺时间太长，且玻璃酸钠中蛋白质含量仍然较高，本专利技术提供了一种降低蛋白质含量的玻璃酸钠的二次解离制备方法。本专利技术通过选取合适的络合沉淀剂、合适的洗涤次数以及解离液的稀释倍数，减少了多次络合过程中的工艺时间，节约了成本；同进进一步降低的玻璃酸钠中的蛋白质及核酸含量。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术提供了一种降低蛋白质含量的玻璃酸钠的制备方法，所述方法包括以下步骤：(1)向鸡冠酶解液中加入十六烷基三甲基氯化铵进行沉淀络合反应至生成的玻璃酸钠完全沉淀，得到沉淀物；(2)向步骤(1)得到的沉淀物中加入洗涤剂进行洗涤，得到洗涤后沉淀物；(3)向步骤(2)得到的洗涤后沉淀物中加入解离液氯化钠溶液进行解离，搅拌至溶液中无颗粒物，得到解离后药液；(4)向步骤(3)得到的解离后药液中加入稀释剂进行稀释至沉淀完全，得到玻璃酸钠沉淀物；(5)向步骤(4)得到的玻璃酸钠沉淀物中加入洗涤剂进行洗涤，得到洗涤后的玻璃酸钠沉淀物；(6)向步骤(5)经洗涤后的玻璃酸钠沉淀物中加入解离液氯化钠溶液进行解离，搅拌至溶液中无颗粒物，经过后处理得到玻璃酸钠。本专利技术中，所用鸡冠酶解液为鸡冠经粗洗、精洗绞碎、酶解和活性炭吸附后所得的药液，其具体操作过程为现有技术，故不再赘述。本专利技术中，玻璃酸钠的阴离子与表面活性物质形成络合物，这些络合物在低离子强度的水溶液中不溶解，形成沉淀；在高离子强度时溶解，得到溶液。本专利技术所述方法通过选取合适的络合沉淀剂以及合适的解离次数，减少了多次络合过程中的工艺时间，节约了成本；同时，使制得的玻璃酸钠溶液中的蛋白质含量明显降低，达到现行最高质量标准要求的蛋白质含量控制方法，使制得的玻璃酸钠原料药中的蛋白质含量低于0.05wt％。以下作为本专利技术优选的技术方案，但不作为本专利技术提供的技术方案的限制，通过以下技术方案，可以更好的达到和实现本专利技术的技术目的和有益效果。作为本专利技术优选的技术方案，步骤(1)中所述十六烷基三甲基氯化铵的加入量不低于鸡冠酶解液质量的0.25wt％，例如0.25wt％、0.27wt％、0.3wt％、0.5wt％、0.7wt％、0.9wt％、1wt％、1.5wt％、2wt％、2.5wt％或3wt％等以及更高，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用，优选为鸡冠酶解液质量的0.25wt％～0.3wt％。此处，所述“不低于”为“大于等于”。优选地，步骤(1)中所述沉淀络合反应的时间为10min～20min，例如10min、11min、12min、13min、14min、15min、16mn、17min、18min、19min或20min等，优选为15min。作为本专利技术优选的技术方案，步骤(2)中所述洗涤剂为纯化水。优选地，步骤(2)中所述洗涤剂的加入量为沉淀物质量的4倍～6倍，例如4倍、4.3倍、4.5倍、4.7倍、5倍、5.3倍、5.5倍、5.7倍或6倍等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用，优选为5倍。优选地，步骤(2)中所述洗涤过程中进行搅拌，所述搅拌频率为40Hz～60Hz，例如40Hz、43Hz、45Hz、47Hz、50Hz、53Hz、55Hz、57Hz或60Hz等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用，优选为50Hz。优选地，所述搅拌时间为5min～15min，例如5min、7min、10min、13min或15min等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用，优选为10min。优选地，步骤(2)所述洗涤次数为8次～12次，例如8次、9次、10次、11次或12次等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用，优选为10次。本专利技术中，对络合沉淀物进行洗涤有利于产物中蛋白质含量的降低，但并非洗涤次数越多越好，洗涤次数过多对蛋白质含量的降低的影响较低，洗涤次数以10为最优。作为本专利技术优选的技术方案，步骤(3)所述氯化钠溶液的浓度为0.3mol/L～0.4mol/L，例如0.3mol/L、0.31mol/L、0.33mol/L、0.35mol/L、0.37mol/L、0.39mol/L或0.4mol/L等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用，优选为0.35mol/L。作为本专利技术优选的技术方案，步骤(4)中所述稀释剂为纯化水。优选地，步骤(4)中所述稀释剂为温度为7℃～20℃的纯化水，所述纯化水的温度可为7℃、9℃、10℃、13℃、15℃、17℃或20℃等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。优选地，步骤(4)所述稀释剂的用量为步骤(3)得到的解离后药液的至少8倍体积量，例如8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍或14倍等以及更高本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种降低蛋白质含量的玻璃酸钠的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)向鸡冠酶解液中加入十六烷基三甲基氯化铵进行沉淀络合反应至生成的玻璃酸钠完全沉淀，得到沉淀物；(2)向步骤(1)得到的沉淀物中加入洗涤剂进行洗涤，得到洗涤后沉淀物；(3)向步骤(2)得到的洗涤后沉淀物中加入解离液氯化钠溶液进行解离，搅拌至溶液中无颗粒物，得到解离后药液；(4)向步骤(3)得到的解离后药液中加入稀释剂进行稀释至沉淀完全，得到玻璃酸钠沉淀物；(5)向步骤(4)得到的玻璃酸钠沉淀物中加入洗涤剂进行洗涤，得到洗涤后的玻璃酸钠沉淀物；(6)向步骤(5)经洗涤后的玻璃酸钠沉淀物中加入解离液氯化钠溶液进行解离，搅拌至溶液中无颗粒物，经过后处理得到玻璃酸钠。

【技术特征摘要】
1.一种降低蛋白质含量的玻璃酸钠的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)向鸡冠酶解液中加入十六烷基三甲基氯化铵进行沉淀络合反应至生成的玻璃酸钠完全沉淀，得到沉淀物；(2)向步骤(1)得到的沉淀物中加入洗涤剂进行洗涤，得到洗涤后沉淀物；(3)向步骤(2)得到的洗涤后沉淀物中加入解离液氯化钠溶液进行解离，搅拌至溶液中无颗粒物，得到解离后药液；(4)向步骤(3)得到的解离后药液中加入稀释剂进行稀释至沉淀完全，得到玻璃酸钠沉淀物；(5)向步骤(4)得到的玻璃酸钠沉淀物中加入洗涤剂进行洗涤，得到洗涤后的玻璃酸钠沉淀物；(6)向步骤(5)经洗涤后的玻璃酸钠沉淀物中加入解离液氯化钠溶液进行解离，搅拌至溶液中无颗粒物，经过后处理得到玻璃酸钠。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述十六烷基三甲基氯化铵的加入量不低于鸡冠酶解液质量的0.25wt％，优选为鸡冠酶解液质量的0.25wt％～0.3wt％；优选地，步骤(1)中所述沉淀络合反应的时间为10min～20min，优选为15min。3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述洗涤剂为纯化水；优选地，步骤(2)中所述洗涤剂的加入量为沉淀物质量的4倍～6倍，优选为5倍；优选地，步骤(2)中所述洗涤过程中进行搅拌，所述搅拌频率为40Hz～60Hz，优选为50Hz；优选地，所述搅拌时间为5min～15min，优选为10min；优选地，步骤(2)所述洗涤次数为8次～12次，优选为10次。4.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述氯化钠溶液的浓度为0.3mol/L～0.4mol/L，优选为0.35mol/L。5.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述稀释剂为纯化水；优选地，步骤(4)中所述稀释剂为温度为7℃～20℃的纯化水；优选地，步骤(4)所述稀释剂的用量为步骤(3)得到的解离后药液的至少8倍体积量，优选为10倍体积量；优选地，步骤(4)中加入稀释剂的过程中边加边搅拌；优选地，所述搅拌频率为40Hz～60Hz，优选为50Hz；优选地，步骤(4)中稀...

【专利技术属性】
技术研发人员：何文汇，王琼，
申请(专利权)人：上海景峰制药有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31