红锥无菌外植体制备及初始芽诱导方法技术

本发明专利技术公开了一种红锥无菌外植体制备及初始芽诱导方法，包括外植体准备、外植体消毒处理以及初始芽诱导工序，采集红锥当年生嫩枝作为外植体，进行消毒处理后，获得的无菌外植体接种于初始芽诱导培养基中，在适宜环境中培养20‑30天后，获得生长快、活力旺盛的红锥初始芽。本发明专利技术选取当年红锥生嫩枝为组培繁殖材料，采用一定的浓度及消毒时间的多种药剂相配合的消毒处理的方式，无菌外植体获取率高，达到90%以上，使用了优化诱导培养基及培养方式，外植体褐化少，初始芽发生率高，芽苗伸长快、活力旺盛，具有较好的经济效益和社会效益。

Preparation of red cone aseptic explant and initial bud induction method

The invention discloses a red cone sterile explant preparation and initial bud induction method, including explant preparation, disinfection of explants and the initial bud induction process, then shoots the red cone collection as explants, disinfected, sterile explants were obtained from the bud induction medium, culture 20 in suitable environment in 30 days, get the red cone bud of fast growth, strong vitality. The invention selects the red cone shoots breeding material for tissue culture, combined with various agents with certain concentration and time of disinfection disinfection way, sterile explants obtained high rate reached more than 90%, the use of optimized induction medium and culture method, the explant browning, the initial sprouting rate is high, shoot elongation fast, vigorous, with good economic and social benefits.

【技术实现步骤摘要】
红锥无菌外植体制备及初始芽诱导方法
本专利技术属于植物组织培养
，尤其是涉及一种红锥无菌外植体制备及初始芽诱导方法。
技术介绍
红锥(CastanopsishystrixA.DC)隶属壳斗科(Fagaceae)栲属(Castanopsis)，成年树高可达30m，胸径1m以上，是我国南亚热带和亚热带植被常绿阔叶林的优势组成树种，属华南地区重要的乡土阔叶珍贵用材和高效多用途生态公益林树种。红锥天然分布于东经95°20′～118°00′，北纬18°30′～25°00′，主产地集中于广东、广西、福建南部，其周边分布在海南、云南南部、贵州东南部以及湖南、江西等省南部。红锥具有生长快、材质优、适应广、效益高等优良特性。其主干通直，材质坚硬，呈红色，色泽和纹理美观，耐腐蚀性强，不开裂、不变形、易加工，是优质珍贵用材，可供建筑、造船、高档家具、木制地板、军工用品、体育器材等用。种子富含淀粉，可用于炒食、饲料和酿酒，种实、壳斗均富含单宁，可提制栲胶。红锥林萌芽力强，萌条生长迅速，一次造林可采伐10次以上，合理经营可获利上百年。红锥枝叶浓密，较耐荫蔽，混生性能好，可作为用材和水源涵养林进行纯林种植，亦可为残次林改造，生态公益林改造的混交造林。目前我国多个省如广东、广西、福建等将红锥推选为当地区经济价值高、发展前途大的优良树种进行推广，造林面积大，推广应用前景广。目前红锥人工林栽培所用苗木多采用混采种子育苗，导致苗木及其造林后的林分个体分化大，参差不齐，进而影响到人工林的造林质量、产量及经济效益。通过科技工作者近十几年的研究，已选育出一批红锥优良单株，但由于所选优株数量有限，加之树龄年轻，结实率低，所收获种子远不能满足造林需求。前期研究表明，红锥优树无论采用嫁接还是扦插进行繁殖，繁殖率低，同时存在程度不同的偏冠现象，所繁育苗木难以用于生产。以红锥优树萌枝进行组培研究虽有报道，但仍存在出芽慢，无菌系建立困难等问题，难以用于生产。
技术实现思路
本专利技术针对现有红锥组织培养中外植体消毒困难、褐化、初始芽发生率低、芽苗活性差等的技术问题，提供一种红锥无菌外植体制备及初始芽诱导的方法。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案如下一种红锥无菌外植体制备及初始芽诱导方法，包括外植体准备、外植体消毒处理以及初始芽诱导工序，采集红锥当年生嫩枝作为外植体，进行消毒处理后，获得的无菌外植体接种于初始芽诱导培养基中，在适宜环境中培养20-30天后，获得生长快、活力旺盛的红锥初始芽，其操作步骤如下：（1）外植体准备：在至少连续3天晴朗的气候里，采集红锥的树冠外围生长健壮的当年生嫩枝作为外植体；（2）外植体消毒处理：将外植体用无菌水冲洗干净后，置于体积浓度为0.1-0.3%的广谱杀菌剂中浸泡20-30min，取出外植体将其置于体积浓度为70%酒精中浸泡1-2min，再移入体积浓度为5-8%的氯化汞溶液中浸泡10-20min，取出放于体积浓度为10-25%的双氧水和2-5滴吐温的混合液中搅拌浸泡20-30min后，最后用无菌水洗3-4次，每次冲洗3-5min；将外植体裁成带至少1个腋芽，1.5-3cm长的茎段，视茎段木质化程度分类置放容器内，备用；将步骤（2）得到的外植体接种于诱导培养基中；所述的诱导培养基为：改良1/2MS培养基+IBA0.5-1.5mg·L-1+MT1.0-3.0mg·L-1+6-BA1.0-3.0mg·L-1+葡萄糖30g·L-1+琼脂3.5g·L-1+0.1-0.3%广谱杀菌剂；初始芽诱导培养周期为：20-30天，置于温度：20±3℃，光照培养时间为：16h，光照强度为：≤1000lx的环境中进行初始芽诱导培养，获得生长健壮、活力旺盛的红锥初始芽。初始芽萌动率在90%以上。以上所述的改良MS培养基的组成为：KNO31350mg·L-1；NH4NO3650mg·L-1；CaCl2·2H2O180mg·L-1；MgSO4·7H2O380mg·L-1；Ca(NO3)2·4H2O460mg·L-1；KH2PO4220mg·L-1；MnSO4·H2O22.3mg·L-1；ZnSO4·7H2O8.6mg·L-1；CuSO4·5H2O0.025mg·L-1；H3BO36.2mg·L-1；Na2MoO4·2H2O0.025mg·L-1；KI0.83mg·L-1；CoCl2·6H2O0.025mg·L-1；维生素B11.5mg·L-1；维生素B60.6mg·L-1；烟酸0.5mg·L-1；甘氨酸2.0mg·L-1；肌醇200mg·L-1。优选的，以上适宜条件为：温度：20±3℃，光照培养时间为：12h，光照强度为：≤1000lx。对比于现有技术，本专利技术的优点及积极效果如下：1、本专利技术选取当年红锥生嫩枝为组培繁殖材料，外植体的萌芽条幼态化程度高，极大地提高了外植体的有效性，从而成功建立一种红锥茎段组培方法，本方法对加快红锥优质壮苗的生产，促进国家硬木用材快速发展，调整林业品种结构具有重大意义。2、本专利技术依次采用一定的浓度及消毒时间的广谱杀菌剂、酒精、氯化汞、双氧水和吐温相配合的消毒处理的方式，无菌外植体获取率高，达到90%以上。3、本专利技术使用优化诱导培养基及培养方式，外植体褐化少，初始芽发生率高，芽苗伸长快、活力旺盛，具有较好的经济效益和社会效益。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进一步说明。实施例1：在至少连续3天晴朗的气候里，采集红锥的树冠外围生长健壮的当年生嫩枝作为外植体。将外植体用无菌水冲洗干净后，置于体积浓度为0.1%的广谱杀菌剂中浸泡30min，取出外植体将其置于体积浓度为70%酒精中浸泡1min，再移入体积浓度为5%的氯化汞溶液中浸泡20min，取出放于体积浓度为10%的双氧水和2滴吐温的混合液中搅拌浸泡30min后，最后用无菌水洗3次，每次冲洗5min；将外植体裁成带至少1个腋芽，1.5-2.0cm长的茎段，视茎段木质化程度分类置放容器内，备用；将消毒处理后得到的外植体接种于诱导培养基中；所述的诱导培养基为：改良1/2MS培养基+IBA0.5mg·L-1+MT1.0mg·L-1+6-BA1.0mg·L-1+葡萄糖30g·L-1+琼脂3.5g·L-1+0.1%广谱杀菌剂；初始芽诱导培养周期为：20-35天，置于温度：20±3℃，光照培养时间为：12h，光照强度为：≤1000lx的环境中进行初始芽诱导培养，获得生长健壮、活力旺盛的红锥初始芽，初始芽萌动率95%。所述的改良MS培养基的组成为：KNO31350mg·L-1；NH4NO3650mg·L-1；CaCl2·2H2O180mg·L-1；MgSO4·7H2O380mg·L-1；Ca(NO3)2·4H2O460mg·L-1；KH2PO4220mg·L-1；MnSO4·H2O22.3mg·L-1；ZnSO4·7H2O8.6mg·L-1；CuSO4·5H2O0.025mg·L-1；H3BO36.2mg·L-1；Na2MoO4·2H2O0.025mg·L-1；KI0.83mg·L-1；CoCl2·6H2O0.025mg·L-1；维生素B11.5mg·L-1；维生素B60.6mg·L-1；烟酸0.5mg·L-1；甘氨酸2.0mg·L-1；肌醇200mg·L-1。实施例2：在至少连续3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种红锥无菌外植体制备及初始芽诱导方法，其特征在于：包括外植体准备、外植体消毒处理以及初始芽诱导工序，采集红锥当年生嫩枝作为外植体，进行消毒处理后，获得的无菌外植体接种于初始芽诱导培养基中，在适宜环境中培养20‑30天后，获得生长快、活力旺盛的红锥初始芽，其操作步骤如下：（1）外植体准备：在至少连续3天晴朗的气候里，采集红锥的树冠外围生长健壮的当年生嫩枝作为外植体；外植体消毒处理：将外植体用无菌水冲洗干净后，置于体积浓度为0.1‑0.3 %的广谱杀菌剂中浸泡20‑30 min，取出外植体将其置于体积浓度为70 %酒精中浸泡1‑2 min，再移入体积浓度为5‑8 %的氯化汞溶液中浸泡10‑20 min，取出放于体积浓度为10‑25 %的双氧水和2‑5滴吐温的混合液中搅拌浸泡20‑30 min后，最后用无菌水洗3‑4次，每次冲洗3‑5 min；将外植体裁成带至少1个腋芽，1.5‑3cm长的茎段，视茎段木质化程度分类置放容器内，备用；（3）初始芽诱导：将步骤（2）得到的外植体接种于诱导培养基中；所述的诱导培养基为：改良1/2MS培养基 + IBA 0.5‑1.5 mg·L

【技术特征摘要】
1.一种红锥无菌外植体制备及初始芽诱导方法，其特征在于：包括外植体准备、外植体消毒处理以及初始芽诱导工序，采集红锥当年生嫩枝作为外植体，进行消毒处理后，获得的无菌外植体接种于初始芽诱导培养基中，在适宜环境中培养20-30天后，获得生长快、活力旺盛的红锥初始芽，其操作步骤如下：（1）外植体准备：在至少连续3天晴朗的气候里，采集红锥的树冠外围生长健壮的当年生嫩枝作为外植体；外植体消毒处理：将外植体用无菌水冲洗干净后，置于体积浓度为0.1-0.3%的广谱杀菌剂中浸泡20-30min，取出外植体将其置于体积浓度为70%酒精中浸泡1-2min，再移入体积浓度为5-8%的氯化汞溶液中浸泡10-20min，取出放于体积浓度为10-25%的双氧水和2-5滴吐温的混合液中搅拌浸泡20-30min后，最后用无菌水洗3-4次，每次冲洗3-5min；将外植体裁成带至少1个腋芽，1.5-3cm长的茎段，视茎段木质化程度分类置放容器内，备用；（3）初始芽诱导：将步骤（2）得到的外植体接种于诱导培养基中；所述的诱导培养基为：改良1/2MS培养基+IBA0.5-1.5mg·L-1+MT1.0-3.0mg·L-1+6-BA1.0-3.0mg·L-1+葡萄糖30g·L-1+...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐春艳，陈素云，
申请(专利权)人：唐春艳，陈素云，
类型：发明
国别省市：广西,45