丁胺卡那霉素和卡那霉素二合一快速检测酶联免疫试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术提供了丁胺卡那霉素和卡那霉素二合一快速检测酶联免疫试剂盒，包括酶标板、酶标记抗抗体、丁胺卡那霉素标准品、底物显色液、终止液、洗涤液、丁胺卡那霉素抗体，所述酶标板上包被有丁胺卡那霉素半抗原‑蛋白偶联物。本发明专利技术公开的试剂盒可定性、定量检测鸡蛋和鸡肉样本中丁胺卡那霉素、卡那霉素的残留。鸡蛋和鸡肉样本中丁胺卡那霉素和卡那霉素的检测方法，首先处理待测鸡蛋和鸡肉样本，然后用酶联免疫试剂盒进行检测，最后分析检测结果。本发明专利技术提供的酶联免疫试剂盒，结构简单、使用方便、携带便利、检测方法高效、准确、简便、适于大批量样品定性、定量的检测。

Amikacin and kanamycin two in one rapid detection enzyme-linked immunosorbent assay kit and uses thereof

The present invention provides amikacin and kanamycin in rapid detection of ELISA kit, including ELISA plate, enzyme labeled antibody, amikacin standard, chromogenic substrate solution and stop solution, washing liquid, amikacin antibody, the ELISA plate coated with amikacin hapten protein conjugates. The kit disclosed by the invention can qualitatively and quantitatively detect the residues of amikacin and kanamycin in eggs and chicken samples. The detection methods of amikacin and kanamycin in eggs and chicken samples were first treated with eggs and chicken samples, then detected by ELISA kit, and the results were analyzed at last. The ELISA kit provided by the invention has the advantages of simple structure, convenient use, portability, high efficiency, accuracy, simplicity and suitability for the qualitative and quantitative detection of a large number of samples.

【技术实现步骤摘要】
丁胺卡那霉素和卡那霉素二合一快速检测酶联免疫试剂盒及其应用
本专利技术涉及酶联免疫检测技术，具体涉及一种丁胺卡那霉素和卡那霉素二合一快速检测酶联免疫试剂盒，其特别适于鸡蛋和鸡肉中丁胺卡那霉素和卡那霉素药物残留的检测。技术背景丁胺卡那霉素(Amikin)又名阿米卡星，见图1，是卡那青霉素a的半合成衍生物的硫酸盐。卡那霉素是一种蛋白质生物合成抑制剂，它可以结合于细菌细胞内的核糖体30s亚基，导致mRNA的错读，来抑制细菌蛋白质的合成抑制细菌生长，临床主要用于对庆大霉素，卡那霉素耐药的革兰阴性杆菌如大肠杆菌、变形杆菌和绿脓杆菌引起的各种感染。长期或反复大量摄入丁胺卡那霉素可导致前庭神经和听神经损害，肾脏出现轻度损害，严重者可出现肾功能衰竭。为了保证人类健康，日本和欧盟等国家和地区制定了卡那霉素的最大残留限量(MRLs)标准：肌肉为100μg/kg、肾脏为2500μg/kg。2002年我国国家质量监督检验检疫局出台的文件中明确限定了卡那霉素在动物源性食品中的最大残留限量：肌肉100μg/kg，肝脏300μg/kg。传统的检测方法有微生物检定法和高效液相色谱法等，这些方法用于鸡蛋或鸡肉样本中的丁胺卡那霉素或卡那霉素检测，前处理繁琐序复杂，测定周期长，甚至需要昂贵的仪器，成本较高，不能满足鸡蛋和鸡肉样品中丁胺卡那霉素和卡那霉素的实时快速检测。
技术实现思路
针对上述现有技术的不足，本专利技术提供了一种丁胺卡那霉素和卡那霉素二合一快速检测酶联免疫试剂盒，既可以检测丁胺卡那霉素，同时又可以检测卡那霉素，其包括酶标板、酶标记抗抗体、丁胺卡那霉素标准品、底物显色液、终止液、洗涤液、丁胺卡那霉素抗体，所述酶标板上包被有丁胺卡那霉素-蛋白偶联物。所述丁胺卡那霉素-蛋白偶联物由丁胺卡那霉素与卵清蛋白通过偶联得到。所述丁胺卡那霉素抗体为丁胺卡那霉素单克隆抗体或丁胺卡那霉素多克隆抗体。所述丁胺卡那霉素抗体由丁胺卡那霉素-蛋白偶联物作为免疫原制备得到，所述蛋白为牛血清白蛋白、甲状腺蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白。所述丁胺卡那霉素标准品溶液的浓度分别为0μg/kg，0.5μg/kg，1.5μg/kg，4.5μg/kg，13.5μg/kg，40.5μg/kg。所述酶标记抗抗体的标记酶为辣根过氧化物酶，所述显色底物液为显色底物A液和显色底物B液，所述显色底物A液为过氧化脲，显色底物B液为四甲基联苯胺，终止液为2mol/L盐酸。所述洗涤液为含有0.5-1.5‰TritonX-100和0.5‰Proclin300防腐剂的Tris缓冲液,其中，Tris缓冲液浓度为0.05mol/L,pH为8.0，所述千分比均为体积比。本专利技术的另一个目的还提供了一种应用上述丁胺卡那霉素和卡那霉素二合一快速检测酶联免疫试剂盒检测鸡蛋或鸡肉样品中丁胺卡那霉素和卡那霉素残留的方法，其主要包括以下步骤：首先处理待测鸡蛋或鸡肉样品；然后用上述酶联免疫试剂盒进行检测；最后分析检测结果。本专利技术丁胺卡那霉素和卡那霉素二合一快速检测酶联免疫试剂盒主要采用间接竞争ELISA方法定性或定量检测样品中丁胺卡那霉素或卡那霉素药物的残留量；对鸡蛋或鸡肉样品的前处理要求不高，样品前处理过程比较简单，能同时快速检测大批量鸡蛋或鸡肉样品。本专利技术的酶联免疫试剂盒，本身结构简单、使用方便、携带便利、检测方法高效、准确、简便、适于大批量样品定性、定量的检测。本专利技术的酶联免疫试剂盒可以在丁胺卡那霉素和卡那霉素残留检测中发挥重要作用。附图说明图1：丁胺卡那霉素分子式；图2：丁胺卡那霉素标准品曲线拟合曲线。具体实施方式下面结合具体的实施例来进一步阐述本专利技术。这些实施例仅用于说明本专利技术，而不用来限制本专利技术的范围。以下试剂若无特殊说明，均为常规试剂。实施例1丁胺卡那霉素和卡那霉素二合一快速检测酶联免疫试剂盒丁胺卡那霉素和卡那霉素二合一快速检测酶联免疫试剂盒，其包括：1)96孔或48孔酶标板，其上包被丁胺卡那霉素半抗原-卵清蛋白偶联物；2)酶标记抗抗体，为用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体；3)卡那霉素标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/L，0.5μg/L，1.5μg/L，4.5μg/L，13.5μg/L，40.5μg/L；4)底物显色液由底物显色A液和底物显色B液组成，底物显色液A液为过氧化脲，底物显色液B液四甲基联苯胺；5)终止液为2mol/L盐酸；6)洗涤液为含有0.5-1.5‰TritonX-100和0.5‰Proclin300的Tris缓冲液，其中，Tris缓冲液浓度为0.05mol/L,pH为8.0，千分比为体积比；7)丁胺卡那霉素单克隆抗体。实施例2丁胺卡那霉素和卡那霉素二合一快速检测酶联免疫试剂盒主要成分的制备1、免疫原和包被原合成1)免疫原的合成称取BSA20mg使之充分溶解于3mL0.05mol/LMES(pH6.0)缓冲液中，然后迅速加入EDC50mg和NHS50mg，4℃避光，在振荡器中反应12h，得到溶液Ⅰ；称取丁胺卡那霉素标准品50mg，加入1.5mL0.05mol/LMES(pH6.0)缓冲液中，充分溶解，制成丁胺卡那霉素溶液；向溶液Ⅰ中溶液逐滴加入丁胺卡那霉素溶液，边加边搅拌，避光，在4℃下搅拌过夜；过G-25脱盐柱子1次，将脱盐产物装入到处理好的透析袋中，置于0.1mol/L的PBS透析液中，每4h换用一次透析液，透析2天，透析产物分装于1.5mL的离心管中。2)包被原合成称取丁胺卡那霉素标准品40mg，溶于2mL的0.05mol/LPB(pH8.0)缓冲液中，然后加入0.5％戊二醛溶液1mL，4℃，避光搅拌反应2h，得到溶液Ⅰ，备用；然后，配制0.5％OVA溶液5mL，逐滴滴加溶液Ⅰ，边加边搅拌；再向反应溶液中加入约5.0mg硼氢化钠，于4℃避光搅拌反应2h；过G-25脱盐柱子1次，将脱盐产物装入到处理好的透析袋中，置于0.1mol/L的PBS透析液中，每4h换一次透析液，透析2天，透析产物分装于1.5mL的离心管中。2、单克隆抗体的制备1)动物免疫挑选8周龄的Balb/c小鼠，用含有佛氏完全佐剂的丁胺卡那霉素半抗原-牛血清白蛋白偶联物进行皮下注射，免疫剂量为200μg/只，第2，4和8周加强免疫，最后一次免疫在第12周，使其产生多克隆抗体血清。2)骨髓瘤细胞和脾细胞的制备SP2/0骨髓瘤细胞采用常规的RPMI-1640培养液培养，使细胞处于对数生长期，制成SP2/0骨髓瘤细胞细胞悬液；取经免疫的小鼠脾脏，破碎，过400目的不锈钢纱布过滤制成脾细胞悬液，计数后备用。3)细胞融合和单克隆化将(1-3)×108SP2/0骨髓瘤细胞和4×108脾细胞在PEG6000作用下进行融合，对于分泌抗体培养孔，采用间接竞争ELISA测定以筛选阳性孔。采用有限稀释法对阳性孔进行单克隆化，直到得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。该抗体对丁胺卡那霉素的检测灵敏度能达到0.5μg/kg。同时，该抗体与卡那霉素的交叉反应率达到80％，所以该抗体可以用于卡那霉素的检测。4)细胞冻存和复苏将丁胺卡那霉素的单克隆杂交瘤细胞株成(1-3)×106个/mL的细胞悬液，每个冻存管500μL，先在-4℃放置2h，-20℃放置2h，-50℃放置2h，再保存在液氮中。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种丁胺卡那霉素和卡那霉素二合一快速检测酶联免疫试剂盒，包括酶标板、酶标记抗抗体、丁胺卡那霉素标准品、底物显色液、终止液、洗涤液、丁胺卡那霉素抗体，所述酶标板上包被有丁胺卡那霉素‑蛋白偶联物。

【技术特征摘要】
1.一种丁胺卡那霉素和卡那霉素二合一快速检测酶联免疫试剂盒，包括酶标板、酶标记抗抗体、丁胺卡那霉素标准品、底物显色液、终止液、洗涤液、丁胺卡那霉素抗体，所述酶标板上包被有丁胺卡那霉素-蛋白偶联物。2.如权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述丁胺卡那霉素-蛋白偶联物由丁胺卡那霉素与卵清蛋白通过偶联得到。3.如权利要求2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述丁胺卡那霉素抗体为丁胺卡那霉素单克隆抗体或丁胺卡那霉素多克隆抗体。4.如权利要求3所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述丁胺卡那霉素抗体由丁胺卡那霉素-蛋白偶联物作为免疫原制备得到，所述蛋白为牛血清白蛋白、甲状腺蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白。5.如权利要求1或2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述丁胺卡那霉素标准品溶液的浓度分别为0μg/L，0.5μg/L，1...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨绍元，杨少琼，
申请(专利权)人：云南双鱼贝贝健康管理有限公司，
类型：发明
国别省市：云南,53