质谱基片及制备方法与用途技术

本发明专利技术提供了一种在MALDI‑TOF质谱检测中承载BIOMARK生物标记物的专用基片，结构包括：由化学表面改性制成的孔外疏水区域；由特种化学试剂修饰的圈内亲水区域；滴定BIOMARK样本的表面圆孔或方孔；质地坚韧平面度佳的基底材料；单面抛光镜面效应的基片表面。此外，该基片还可包括用于身份识别的二维码。本发明专利技术提供的微纳米结构基片能够有效富集样本，晶向均一生长，BIOMARK生物检测的质谱曲线样本峰准确度高，信噪比高，基线底。

Mass spectrum substrate and preparation method and use thereof

The invention provides a special substrate, carrying BIOMARK biomarkers in MALDI TOF mass spectrometry in structure includes a hole hydrophobic region by chemical surface modification made by the hydrophilic region; special chemical reagent modified circle; the surface of a circular hole or square hole titration of BIOMARK samples; tough texture plane base material good degree of substrate surface; single side polishing mirror effect. In addition, the substrate may include a two-dimensional code for identification. The micro nano structure substrate provided by the invention can effectively enrich the sample and uniformly grow the crystal direction, and the sample peaks of the mass spectrum curve of the BIOMARK biological detection have high accuracy and high signal-to-noise ratio, and the bottom of the base line is high.

【技术实现步骤摘要】
质谱基片及制备方法与用途
本专利技术涉及一种用于MALDI-TOFMS且具有微纳米结构的改进基片，属于质谱检测领域。
技术介绍
MALDI-TOF-MS是MatrixAssistedLaserDesorptionIonizationTimeofFlightMassSpectrometry的英文缩写，即基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱，又称MALDITOF，它是近年来发展起来的一种软电离新型有机质谱，通过引入基质分子，使待测分子不产生碎片，解决了非挥发性和热不稳定性生物大分子解吸离子化的问题，是分析难挥发的有机物质的重要手段之一。MALDITOF在世界范围内得到了突飞猛进的发展，并广泛应用于生物技术和制药企业的药物开发、科研领域的生物分析和化学检测以及安全部门的核辐射、化学物质和生物病原体的监测等。MALDI-TOFMS的原理是：当用一定强度的激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量，样品解吸附，基质-样品之间发生电荷转移使得样品分子电离，电离的样品在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测，即测定离子的质量电荷之比(M/Z)与离子的飞行时间成正比来检测离子。MALDI-TOFMS的中心技术就是依据样品的质荷比(m/z)的不同来进行检测，并测得样品分子的分子量。根据MALDI-TOFMS的原理，MALDI-TOFMS具有灵敏度高、准确度高、分辨率高、图谱简明、质量范围广及速度快等特点，在操作上制样简便、可微量化、大规模、并行化和高度自动化处理待检生物样品，而且在测定生物大分子和合成高聚物应用方面有特殊的优越性。近年来已成为检测和鉴定多肽、蛋白质、多糖、核苷酸、糖蛋白、高聚物以及多种合成聚合物的强有力工具。如应用MALDI-TOFMS测定蛋白质酶解的肽质量指纹图谱(PMF)、源后裂解(PSD)碎片离子图谱、并结合质谱网络数据库检索，可获得多肽、蛋白质的序列。应用MALDI-TOF对基因组单核苷酸多态性(SNPs)进行分析检测，可区分和鉴别相对分子质量达7,000左右(含20多个碱基)、仅存在1个碱基差别的不同DNA。特别值得指出的是，MALDI-TOF已成为生命科学领域蛋白质组研究中必不可缺的重要关键技术之一。MALDI-TOF可以解决当前蛋白组学中以下几种潜在的挑战，即生物标记物的发现、分子诊断研发、蛋白质高通量分析和蛋白质组图谱，但绝不局限于此，MALDI-TOFMS应用于生物标记物的发现和在分子层次上对疾病机理进行揭示，从而被应用于分子诊断、目标治疗以及个性化用药，将为人们更完整地提示生长、发育和代谢调控等生命活动的规律和严重疾病的发生机理，为人类进行疾病的诊断防治和新药开发提供重要的理论基础。MALDI-TOF由于具备快速分析、操作简易、自动化、样品用量少和高通量等特点，可直接检测血清、血浆、尿液、脑脊液、关节腔滑液、支气管洗脱液、细胞裂解液、组织提取物和各种分泌物，应用MALDI-TOF形成规模化的重大疾病、重要生物资源的蛋白质组学、蛋白质组指纹图谱或质谱肽图研究技术平台，可建立具有独立知识产权的蛋白质组数据库，发现疾病的相关蛋白谱和具有重要应用前景的生物标记分子谱，以揭示疾病的发生机制，作为早期诊断、分子分型、疗效及预后判断的依据，并找出可能成为新药设计的分子靶点，为疾病提供新的治疗方案。基于MALDI-TOF的蛋白质组图谱、质谱肽图、生物标记物谱等分析诊断的发展将是分子医学领域的一场革命，它不仅提供了一种新的诊断方法，并且具有很高的可行性，它可在数分钟时间内从微量血液中测出上万个结果并对其进行分析。对此，本专利技术人首先采用MALDI-TOFMS进行血清等生物样品分离、多肽谱快速扫描和疾病特征峰测序，在研究人类重要生理和病理过程中重要生物标志物谱实验确证和分析技术，获得若干与人类重大疾病相关的重要生物标志物谱，应用于重大疾病的早期预警和病程判断。如本专利技术人发现了用于发现恶性肿瘤血清标志物谱，创建具有自主知识产权的我国常见恶性肿瘤人群的“血清质谱多肽谱”，获得肿瘤早期预警、病程判断的质谱数据标准，例如中国授权专利200810172142.0、“一种用于检测肝癌特征蛋白模型的制备方法”、中国授权专利200810147419.4、“用于检测脑胶质瘤特征蛋白质谱模型的制备方法”、中国授权专利201110216986.2、“用于检测肺癌蛋白的质谱模型及构建方法”。另外，根据质谱技术在针对核酸与待测物(如微生物、特定来源成分)或症状(龋齿、老年痴呆、遗传性耳聋)的研究中，本专利技术人也获得众多的中国授权专利，例如中国授权专利201310158363.3、“制备细菌核酸指纹特征谱库的方法”，中国授权专利201310368422.X、“检测龋齿蛋白的质谱模型及构建方法”，中国授权专利201310175514.6、“用于检测与遗传性耳聋相关的基因SNP的引物系统及其用途”。因此，针对MALDI-TOFMS发展用于“血清质谱多肽谱”的疾病相关数据挖掘的生物信息学工具和疾病诊断软件，可应用于临床并推向市场。无论对于科研领域、医疗系统，还是生物市场皆具有广阔的前景。由于在MALDI-TOF的检测载体(靶板或基片)上形成超薄且均一的样品结晶，一直是改进质谱图质量的研究方向之一，因此出现一些相关的研究。中国授权专利201410090967.3、“制备亲疏水相间的微阵列芯片及其用于质谱成像定量分析的方法”提供了一种通过在芯片上设置疏水和亲水区域来制备检测芯片，其中采用丝网印刷技术将疏水性聚合物(聚二甲基硅氧烷或聚甲基丙烯酸甲酯)按照设计好的模板刷在导电玻璃上，其中涂布区为疏水区，空白区作为预留的亲水区。然后，用亲水材料(如样品体系的水溶液)涂布空白区，形成均一间隔的亲水区和疏水区。该方法通过利用丝网印刷技术来设计模板形状，预先在亲水区留出空白区(又称“留白处理”)，因此需要特殊的印刷设备和操作软件，同时在涂布疏水区时靶板要绝对静置。同时，丝网印刷技术的精度低，亲疏水区域的分界不能达到微米精度。并且，需要将待测混合物体系水溶液均匀地铺在亲水区，芯片烘干固化，置于烘箱中60摄氏度固化2h，增加了生产时间和成本。中国授权专利201110401165.6、“对生物样品进行富集和除盐净化处理的方法”公开了一种利用疏水和亲水材料制备具有封闭图案化表面的检测靶板的方法，包括通过在基底上构筑具有较大直径的聚合物涂层(如聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯或光刻胶)作为挡层圆区，然后以含氟单分子层或蒸镀金属层作为疏水层贴在整个基底上。由于该疏水层不能粘附在上述挡层圆区，因此将靶板浸入有机溶剂中进行超声处理，可以除去挡层圆区。最后，再将所述聚合物涂层在所述圆区内部突变较小直径的同心圆，从而获得疏水外圈(含氟单分子层或蒸镀金属层)-亲水中圈-疏水内圈(聚合物涂层)的同心圆图案的质谱靶板，因此该方法又称“挡层涂布”。然而，该方法在基底上构筑疏水-亲水-疏水区域的封闭图案化表面，需要进行两步疏水处理，即采用含氟的试剂在100～250℃下加热生长1～5个小时，工艺复杂，过程耗时。由于该方法需要精确控制两次聚合物涂层的间距，间距过小导致外圈和内圈相连，同时由于使用两种不同的疏水材料来分别突变不同的基底表面，所获得本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于MALDI‑TOF检测的微纳米结构基片的制备方法，包括：(1)选用质地坚韧、平面度佳的基片作为基底；(2)用硅烷偶联剂处理基片：(i)清洗基片：将基片先后浸入丙酮、甲醇水溶液、氯仿，分别清洗后，取出干燥；(ii)在加热条件下，将浓酸和双氧水缓慢加入含有基片的水溶液中，进行充分氧化反应后，分别在氯仿、超纯水中进行清洗，该步骤可重复多次；(iii)将基片置于干净容器中，加入预先水解的硅烷偶联剂溶液，并加入氨水催化，直至硅烷化反应充分完成；(iv)取出基片，分别置于乙醇、超纯水、氯仿中，超声清洗；(v)将清洗后的基片，测量并选择接触角＞120°的基片，作为合格基片；(3)点样区的亲水性处理：将调制后的酸性试剂直接滴在点样区内，通过该酸性试剂对表面进行化学修饰后，形成亲水性孔状结构，然后超声清洗；其中，步骤(1)所述基片是质地坚韧、平面度佳的不锈钢、金刚石、单晶硅、石英晶体的基片；步骤(2)所述硅烷偶联剂选自乙烯基硅烷、氨基硅烷、二甲基二氯硅烷；步骤(3)所述酸性试剂选自氢氟酸(HF)、硫酸(H

【技术特征摘要】
1.一种用于MALDI-TOF检测的微纳米结构基片的制备方法，包括：(1)选用质地坚韧、平面度佳的基片作为基底；(2)用硅烷偶联剂处理基片：(i)清洗基片：将基片先后浸入丙酮、甲醇水溶液、氯仿，分别清洗后，取出干燥；(ii)在加热条件下，将浓酸和双氧水缓慢加入含有基片的水溶液中，进行充分氧化反应后，分别在氯仿、超纯水中进行清洗，该步骤可重复多次；(iii)将基片置于干净容器中，加入预先水解的硅烷偶联剂溶液，并加入氨水催化，直至硅烷化反应充分完成；(iv)取出基片，分别置于乙醇、超纯水、氯仿中，超声清洗；(v)将清洗后的基片，测量并选择接触角＞120°的基片，作为合格基片；(3)点样区的亲水性处理：将调制后的酸性试剂直接滴在点样区内，通过该酸性试剂对表面进行化学修饰后，形成亲水性孔状结构，然后超声清洗；其中，步骤(1)所述基片是质地坚韧、平面度佳的不锈钢、金刚石、单晶硅、石英晶体的基片；步骤(2)所述硅烷偶联剂选自乙烯基硅烷、氨基硅烷、二甲基二氯硅烷；步骤(3)所述酸性试剂选自氢氟酸(HF)、硫酸(H4SO2)、溴化氢(HBr)。2.权利要求1的方法，其中方法包括：步骤(4)激光刻印二维码，该二维码通过与病人的生物信息或样品的来源信息关联，可用于识别基片身份识别。3.权利要求1或2的方法，其中所述基片是单面抛光的硅基片或石英基片；所述接触角＞150°，以形成超疏水表面，或者所述疏水表面的厚度在纳米到微米量级。4.权利要求1或2的方法，其中点样区被划隔成适合MALDI-TOF样品室规格的长方形，划隔精度小于10μm；并通过光刻掩膜版，在基片表面形成亲疏水区域，并将边界精度达到微米级别。5.权利要求1-4中任一所述的方法，其中在进行质谱检测时，可用读码器或扫码器读取二维码，并将基片对应的病人生物信息或样品的来源信息以及对应的质谱数据同时输入电脑进行编码、存储和识别。6.权利要求5的方法，其中所述基片上的亲水点样区数量为48、56、70、9...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁飞，马庆伟，陈莲莲，付书辉，梁坤，向华，
申请(专利权)人：北京毅新博创生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11