检测猪蓝耳病毒经典毒株、高致病性变异毒株和NADC‑30毒株的RT‑PCR方法技术

本发明专利技术公开了一种检测猪蓝耳病毒经典毒株、高致病性变异毒株和NADC‑30毒株的RT‑PCR方法，本发明专利技术参考GenBank中发表的猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)Nsp2基因序列，应用Primer5.0软件设计了一对引物。这对引物可用于RT‑PCR方法检测猪蓝耳病毒三种氨基酸数目不同的亚型。本发明专利技术的灵敏性高、特异性好，能够成功检测出猪蓝耳病毒三种亚型—经典毒株、高致病性变异毒株和NADC‑30毒株，可以对疑似患有猪蓝耳病毒的临床样本进行检测，从而用于猪蓝耳病毒的诊断及流行病学监测。

【技术实现步骤摘要】
检测猪蓝耳病毒经典毒株、高致病性变异毒株和NADC-30毒株的RT-PCR方法
本专利技术属于分子生物学
，具体地说，涉及一种检测猪蓝耳病毒经典毒株、高致病性变异毒株和NADC-30毒株的RT-PCR方法。
技术介绍
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)又称为猪蓝耳病，以引起母猪流产，产死胎、弱胎、木乃伊胎以及仔猪和育肥猪呼吸困难、败血症、高死亡率为主要特征。该病在世界各地普遍存在，给我国的养猪业造成严重的经济损失。近年来，PRRSV的变异现象引起了人们的关注，国外的研究表明，同一基因型的分离毒株之间存在明显的序列差异，PRRSV的变异是造成本病难以控制的重要原因之一。目前国际上根据PRRSV的抗原特性，可将其分为欧洲型和美洲型2个血清型，美洲型毒株又根据其在非结构蛋白NSP2碱基数的缺失分为三种亚型，分别为经典毒株、高致病性变异毒株和NADC-30毒株。RT-PCR方法具体操作步骤是先用特异性引物扩增样品核酸的特异片段基因，取PCR产物跑琼脂糖凝胶电泳，然后在凝胶成像仪拍照观察，依据目的基因片段大小判断是否为NADC-30目标片段，如基因片段大小为493bp，判定为猪蓝耳病毒阳性，如基因片段大小为860bp，则判定为高致病性猪蓝耳病毒阳性，如果基因片段大小为757bp，则判定为猪蓝耳病毒类NADC-30毒株阳性，否则判定为阴性。RT-PCR方法特异性和灵敏度高。目前现有技术中没有一种同时检测猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)三种亚型(经典毒株、高致病性变异毒株、NADC-30毒株)的RT-PCR方法。采用单一对引物分别用PCR扩增三种亚型存在操作复杂、检测时间长等缺点，不能及时了解检测样本PRRS的基因特点。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术针对采用单一对引物分别用PCR扩增三种亚型存在操作复杂、检测时间长的问题，提供了一种检测猪蓝耳病毒经典毒株、高致病性变异毒株、NADC-30毒株的RT-PCR方法，可以对疑似患有猪蓝耳病毒的临床样本进行检测，从而用于猪蓝耳病毒的诊断及流行病学监测。目前三种不同亚型的蓝耳病病毒在猪群中普遍存在，但未有同时检测三种亚型的蓝耳病病毒的检测方法。本专利技术在多株PRRSVNsp2基因序列比对基础上，设计了一对可区分经典毒株、高致病性毒株和NADC30毒株三种不同基因型PRRSV的特异性引物，本专利技术是一种简单、快速、灵敏度高和特异强的检测方法。为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种检测猪蓝耳病毒经典毒株、变异株和NADC-30样毒株的引物，用于RT-PCR反应，该引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示。本专利技术还提供一种检测猪蓝耳病毒经典毒株、高致病性变异毒株和NADC-30毒株的RT-PCR方法，包括以下步骤：以待检测样品的RNA为模板，反转录得到cDNA，用上述的引物，对待测样本进行RT-PCR扩增，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物；扩增产物大小为887bp，则样本中含有或候选含有猪蓝耳病毒经典毒株；扩增产物大小为797bp，则样本中含有或候选含有高致病性变异毒株；扩增产物大小为493bp，则样本中含有或候选含有NADC-30毒株。进一步地，用购自宝生物工程(大连)有限公司的反转录试剂盒进行反转录，所述反转录的步骤为：将RNA模板4μL与1号5×PrimeScriptBuffer4μL、2号PrimeScriptRTEnzymeMix1μL、4号Random6mers2μL和5号RNaseFreedH2O9μL混匀，放入PCR仪上进行反转录。进一步地，反转录的反应条件为：37℃15min，85℃15s，16℃10min。进一步地，所述RT-PCR扩增的反应体系如下：模板cDNA3μL，QuickTaqHSDyeMix10μL，上游引物和下游引物各0.6μL，余下的由ddH2O补足，总量为20μL。进一步地，RT-PCR扩增的反应体系条件如下：94℃预变性2min；94℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸8min。与现有技术相比，本专利技术可以获得包括以下技术效果：1)本专利技术建立的方法对200份疑似患有PRRSV的核酸样本进行RT-PCR检测，检出率为46.5％(93/200)，其中经典毒株检测率为8.5％(17/200)、高致病性变异毒株检出率为28.5％(57/200)和NADC-30毒株检出率为9.5％(19/200)。2)本专利技术具有较高的可靠性，特异性好、灵敏性高，克服了对三种毒株进行分别检测所带来的耗时、耗试剂、增加污染概率的风险，与试剂盒相比对PRRSV的诊断和防治具有更加直接和有效的意义。3)本专利技术不仅操作步骤少，能节约大量时间，比检测PRRSV单重或二重RT-PCR方法更加灵敏、快速，为猪蓝耳病的快速诊断和流行病学调查奠定了基础。当然，实施本专利技术的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。附图说明此处所说明的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，构成本专利技术的一部分，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：图1是本专利技术中阳性模板经55℃-61℃11个退火温度RT-PCR扩增后，1.5％琼脂糖凝胶电泳图，其中，M代表DNA标准Ⅱ，N代表阴性对照，1-7代表实验样本，分别为55℃，56℃，57℃，58℃，59℃，60℃和61℃，其中57℃为最适退火温度；图2是是本专利技术中阳性模板与不同浓度上下游引物0.2μL-1μL混合后RT-PCR扩增后，1.5％琼脂糖凝胶电泳图；其中，M代表DNA标准Ⅱ，N代表阴性对照，1-5泳道为与0.2μL、0.4μL、0.6μL、0.8μL、1μL浓度混合后的实验样本，其中0.6μL为最佳引物浓度；图3是本专利技术中阳性模板用无菌水从10-1到10-9做10倍连续稀释后经RT-PCR后，1.5％琼脂糖凝胶电泳图；其中，M代表DNA标准Ⅱ，N代表阴性对照，1-5泳道依次阳性模板稀释倍数为：1.0×10-3、1.0×10-4、1.0×10-5、1.0×10-6和1.0×10-7。具体实施方式以下将配合实施例来详细说明本专利技术的实施方式，藉此对本专利技术如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。实施例1引物设计根据NCBI登陆的PRRSV基因的三个亚型序列(猪蓝耳病毒经典毒株(EF536003)、高致病性变异株(EF112445)和NADC-30毒株(JN654459))，应用Primer5.0软件设计针对PRRSV的Nsp2基因使用可以区分猪蓝耳病毒经典毒株、高致病性变异株和NADC-30毒株的特异性引物，所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。上游引物(Nsp2F引物)：GACACCTCCTTTGATTGG，SEQIDNO:1；下游引物(Nsp2R引物)：GAGAGGAIGCAGACAAATC(其中I代表T或C或A或G)，SEQIDNO:2；使用上述引物RT-PCR扩增，可以通过琼脂糖凝胶电泳条带的大小对PRRSV的三种亚型进行快捷的鉴别区分，特异性和灵敏度高，操作简単。实施例2检测猪蓝耳病毒经典毒株、高致病性变异毒株和NADC-30毒株的RT-P本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测猪蓝耳病毒经典毒株、高致病性变异毒株和NADC‑30毒株的引物，用于RT‑PCR反应，其特征在于，该引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

【技术特征摘要】
1.一种检测猪蓝耳病毒经典毒株、高致病性变异毒株和NADC-30毒株的引物，用于RT-PCR反应，其特征在于，该引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示。2.一种检测猪蓝耳病毒经典毒株、高致病性变异毒株和NADC-30毒株的RT-PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：以待检测样品的RNA为模板，反转录得到cDNA，用权利要求1中所述的引物，对待测样本进行RT-PCR扩增，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物；扩增产物大小为887bp，则样本中含有或候选含有猪蓝耳病毒经典毒株；扩增产物大小为797bp，则样本中含有或候选含有高致病性变异毒株；扩增产物大小为493bp，则样本中含有或候选含有NADC-30毒株。3.根据权利要求2所述的检测猪蓝耳病毒经典毒株、高致病性变异毒株和NADC-30毒株的RT-PCR方法，其特征在于，用购自宝生物工程(大连)有限公司的反转录试剂盒进行反转录，所述反转录的步骤为：将RNA模板4μL与1号5×PrimeScri...

【专利技术属性】
技术研发人员：张斌，岳华，汤承，王远微，覃思楠，
申请(专利权)人：西南民族大学，
类型：发明
国别省市：四川,51