检测ADAMTS13基因全外显子的试剂盒和方法技术

本发明专利技术公开了检测ADAMTS13基因全外显子的试剂盒和方法，所述试剂盒包括扩增覆盖ADAMTS13基因全外显子序列的26对正、反向引物，所述PCR扩增的上游引物5’端和下游引物5’端分别加了一段长18bp的M13‑F引物序列和长16bp的M13‑R引物序列。基于采用Sanger测序法，利用1对通用引物M13为测序引物，检测ADAMTS13基因全外显子序列的突变情况，应用于血栓性血小板减少性紫癜患者的基因诊断。

【技术实现步骤摘要】
检测ADAMTS13基因全外显子的试剂盒和方法
本专利技术属生命科学和生物
，特别涉及检测ADAMTS13基因全外显子突变的试剂盒和方法。
技术介绍
1924年，EliMoschcowitz最初详述了血栓性血小板减少性紫癜(thromboticthrombocytopenicpurpura，TTP)，其在临床上主要表现为典型的三联征:即血小板减少，微血管病性溶血性贫血，神经系统损伤；若同时伴有肾脏损害及发热，则形成TTP经典的“五联征”。1997年，慢性复发性TTP患者缓解期血浆中的超大分子量vWF多聚体与vWF裂解酶的缺失之间的联系正式确立。此后，研究者们将这种水解蛋白酶纯化，对先天性TTP家族成员进行了全基因组连锁分析。ADAMTS13基因位于9q34，长度为37kb，包含29个外显子。Zheng等首次对ADAMTS13进行了克隆，并将其列为ADAMTS家族的新成员，称为ADAMTS13。先天性TTP的发病率小于5％，由于严重的ADAMTS13缺乏所致，与ADAMTS13基因突变有关。现已报道的ADAMTS13突变已经超过140种，包括错义突变、小片段缺失和插入、无义突变以及结合点突变等等。ADAMTS13的基因突变波及整个ADAMTS13蛋白，主要是降低其分泌和(或)酶活性。获得性TTP80％的TTP患者属于获得性TTP，通常由于循环ADAMTS13自身抗体所致。这些抗体能够抑制ADAMTS13蛋白的活性，但是也有10％－15％的患者体内没有抑制性抗体，而是由于增加了抗体调节的ADAMTS13清除率导致ADAMTS13活性严重减低所致。直接突变检测通过DNA测序仪对ADAMTS13基因直接测序，找出突变的确切位置，可提供更为准确的信息。由于实现了自动化操作，我们采用的PCR结合DNA直接测序方法，因而大大缩短了诊断时间，节省了的人力和物力，测序效率高，能够确定基因突变的位置和形式，结果也更为明确。多种基因突变检测技术包括蛋白截断试验(PTT)、单链构象多态性(SSCP)、异源双链分析(HA)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE)等方法,但所有这些方法均有一定的局限性,从而限制了基因突变的检出率。目前常用的基因突变检测的方法是基因测序和荧光定量PCR等。由于ADAMTS13容量大、突变类型多、突变位点散在分布,故而阻止了对ADAMTS13基因突变的深入研究，荧光定量PCR法并不适用。本专利技术采用Sanger测序法检测ADAMTS13基因全外显子序列的突变，并且设计的引物可以扩展全外显子序列，通过测序结果的分析，可以很直观的了解ADAMTS13基因全外显子的基因突变情况，并不受ADAMTS13的基因突变多样化以及没有突变热点的影响，并且很大程度的节省了检测成本。
技术实现思路
本专利技术提供检测ADAMTS13基因全外显子的引物，采用Sanger测序法，可用于快速检测ADAMTS13基因全外显子突变的情况，用于TTP的基因诊断。本专利技术的目的在于提供检测ADAMTS13基因全外显子的引物，包括：扩增覆盖检测ADAMTS13基因全外显子突变的26对正、反向引物；其碱基序列为：进一步地，引物序列ADAMTS13-1F、ADAMTS13-1R是扩增ADAMTS13基因第1号外显子序列的引物，引物序列ADAMTS13-2F、ADAMTS13-3R是扩增ADAMTS13基因第2号外显子序列的引物，引物序列ADAMTS13-5-6F、ADAMTS13-5-6R是扩增ADAMTS13基因第5和6号外显子序列的引物，以此类推，引物序列ADAMTS13-17-18F、ADAMTS13-17-18R是扩增ADAMTS13基因第17和18号外显子序列的引物，引物序列ADAMTS13-29F、ADAMTS13-29R是扩增ADAMTS13基因第29号外显子序列的引物。进一步地，所述26对正、反向引物的使用浓度为1:1；本专利技术的目的还在于提供一种检测ADAMTS13基因全外显子的方法，其包括如下步骤：(1)提取样品DNA；(2)利用26对扩增引物ADAMTS13-1F与ADAMTS13-1R；ADAMTS13-2F与ADAMTS13-2R；ADAMTS13-3F与ADAMTS13-3R；ADAMTS13-4F与ADAMTS13-4R；ADAMTS13-5-6F与ADAMTS13-5-6R；ADAMTS13-7F与ADAMTS13-7R；ADAMTS13-8F与ADAMTS13-8R；ADAMTS13-9F与ADAMTS13-9R；ADAMTS13-10-11F与ADAMTS13-10-11R；ADAMTS13-12F与ADAMTS13-12R；ADAMTS13-13F与ADAMTS13-13R；ADAMTS13-14F与ADAMTS13-14R；ADAMTS13-15F与ADAMTS13-15R；ADAMTS13-16F与ADAMTS13-16R；ADAMTS13-17-18F与ADAMTS13-17-18R；ADAMTS13-19F与ADAMTS13-19R；ADAMTS13-20F与ADAMTS13-20R；ADAMTS13-21F与ADAMTS13-21R；ADAMTS13-22F与ADAMTS13-22R；ADAMTS13-23F与ADAMTS13-23R；ADAMTS13-24F与ADAMTS13-24R；ADAMTS13-25F与ADAMTS13-25R；ADAMTS13-26F与ADAMTS13-26R；ADAMTS13-27F与ADAMTS13-27R；ADAMTS13-28F与ADAMTS13-28R；ADAMTS13-29F与ADAMTS13-29R对(1)中的DNA分别进行扩增，获得覆盖检测ADAMTS13基因全外显子的扩增产物；(3)利用1对测序引物M13-F与M13-R对(2)中的扩增产物进行正向和反向测序，获得所述扩增产物的基因序列；(4)将(3)中的基因序列与野生型ADAMTS13基因序列进行比较，确定突变位点是否存在；其中所述引物序列为：本专利技术的目的还在于提供一种检测ADAMTS13基因全外显子的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括样品DNA抽提试剂；无水乙醇；检测体系PCR反应液、测序体系反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，其中检测体系PCR反应液包括26对扩增引物ADAMTS13-1F与ADAMTS13-1R；ADAMTS13-2F与ADAMTS13-2R；ADAMTS13-3F与ADAMTS13-3R；ADAMTS13-4F与ADAMTS13-4R；ADAMTS13-5-6F与ADAMTS13-5-6R；ADAMTS13-7F与ADAMTS13-7R；ADAMTS13-8F与ADAMTS13-8R；ADAMTS13-9F与ADAMTS13-9R；ADAMTS13-10-11F与ADAMTS13-10-11R；ADAMTS13-12F与ADAMTS13-12R；ADAMTS13-13F与ADAMTS13-13R；ADAMTS13-14F与ADAMTS13-14R；ADAMTS13-15F与ADAMTS13-15R；ADAMTS13-16F与ADAMTS13-本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测ADAMTS13基因全外显子的试剂盒，其特征在于，包括：扩增覆盖检测ADAMTS13基因全外显子的正、反向引物，其碱基序列为：

【技术特征摘要】
1.检测ADAMTS13基因全外显子的试剂盒，其特征在于，包括：扩增覆盖检测ADAMTS13基因全外显子的正、反向引物，其碱基序列为：2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括一对测序引物M13-F和M13-R，其碱基序列为：M13-F：TGTAAAACGACGGCCAGTM13-R：AACAGCTATGACCATG。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述26对正、反向引物的使用浓度比为：ADAMTS13-F:ADAMTS13-R＝1:1。4.一种检测ADAMTS13基因全外显子序列的方法，其包括如下步骤：(1)提取样品DNA；(2)利用26对扩增引物ADAMTS13-1F与ADAMTS13-1R；ADAMTS13-2F与ADAMTS13-2R；ADAMTS13-3F与ADAMTS13-3R；ADAMTS13-4F与ADAMTS13-4R；ADAMTS13-5-6F与ADAMTS13-5-6R；ADAMTS13-7F与ADAMTS13-7R；ADAMTS13-8F与ADAMTS13-8R；ADAMTS13-9F与ADAMTS13-9R；ADAMTS13-10-11F与ADAMTS13-10-11R；ADAMTS13-12F与ADAMTS13-12R；ADAMTS13-13F...

【专利技术属性】
技术研发人员：李文静，刘赵玲，王淑一，
申请(专利权)人：杭州艾迪康医学检验中心有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33