用于扩增荧光假单胞菌基因的双重PCR引物、荧光假单胞菌的检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一组用于扩增荧光假单胞菌基因的双重PCR引物，双重PCR引物包括用于扩增荧光假单胞菌adnA基因的第一引物对，及用于扩增荧光假单胞菌fliC基因的第二引物对；采用第一引物对和第二引物对进行双重PCR，一次PCR反应可以同时得到两段基因片段的扩增产物，进而实现双靶点检测，相比于单一靶点检测方法而言提高了检测结果的可靠性，降低了漏检率，同时也没有增加检测时间，与逐一检测靶点的方法相比还降低了检测费用，提高了检测效率。采用该方法操作简单，能够快速有效地检测具有生物膜形成能力的荧光假单胞菌。

【技术实现步骤摘要】
用于扩增荧光假单胞菌基因的双重PCR引物、荧光假单胞菌的检测方法及试剂盒
本专利技术属于微生物领域，具体涉及一组扩增荧光假单胞菌基因的双重PCR引物。此外，本专利技术还涉及一种检测荧光假单胞菌的试剂盒，以及一种检测荧光假单胞菌的方法。
技术介绍
荧光假单胞菌是原料乳中常见的主要危害嗜冷菌。在原料乳的加工生产过程中，荧光假单胞菌可能会在生产设备管道中或设备表面形成生物膜。生物膜一旦形成，将难以清除，并可能长期危害乳品的质量和安全。当前检测微生物生物膜形成的方法，如结晶紫染色法、显微镜观测法等，只能识别微生物是否具有生物膜的形成能力，但不能鉴别微生物的种类。而能够鉴别微生物的基因检测方法，只能对荧光假单胞菌进行种类识别，不能鉴别荧光假单胞菌的生物膜形成能力。对于乳品生产来说，具有生物膜形成能力的荧光假单胞菌最具危害性，其对乳品生产的质量和安全有重要意义。此前，专利技术人开发了一种检测荧光假单胞菌的检测方法，通过设计一对引物进行单重PCR来检测，由于检测靶点单一，可能存在漏检的情况。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供了一组扩增荧光假单胞菌基因的PCR引物，采用该组引物进行双重PCR，可以特异性地扩增出单个靶点对应的基因扩增片段，一次性进行双靶点检测，降低了漏检率，提高了检测结果的可靠性。具体的，第一方面，提供一组用于扩增荧光假单胞菌基因的双重PCR引物，所述PCR引物包括用于扩增荧光假单胞菌adnA基因的第一引物对，及用于扩增荧光假单胞菌fliC基因的第二引物对；第一引物对：adnA-for：5’-ATGTGGCGTGAAACCAAAAT-3’，adnA-rev：5’-TCAATCATCCGCCTGTTCA-3’；第二引物对：fliC-for：5’-GATGCAGCGCCTGTCTTC-3’，fliC-rev：5’-TCAGTACAGCGGAAGGCA-3’。第二方面，提供了一种检测荧光假单胞菌的试剂盒，包括第一方面所述的第一引物对和第二引物对、PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸和Taq酶。第三方面，提供了一种检测荧光假单胞菌的方法，包括以下步骤：(a)提取待测菌株的基因组DNA，获得模板DNA；(b)进行双重PCR反应，双重PCR反应体系包括：权利要求1所述的第一引物对和和第二引物对、PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、Taq酶、模板DNA以及ddH2O；(c)将步骤(b)反应得到的产物进行电泳。结合第三方面，在第三方面的一种可能的实现方式中，所述步骤(b)中，反应体系中第一引物对的正向引物adnA-for、第一引物对的反向引物adnA-rev、第二引物对的正向引物fliC-for和第二引物对的反向引物fliC-rev的最终浓度均为1μM。结合第三方面或上述某些可能的实施方式，在第三方面的一种可能的实现方式中，所述步骤(b)中，反应体系中Taq酶的最终浓度为0.2-0.5U/μl。结合第三方面或上述某些可能的实施方式，在第三方面的一种可能的实现方式中，所述步骤(b)中，PCR缓冲液包括KCl、Tris-HCl和MgCl2，三者在反应体系中的最终浓度分别为50mM、10mM和1.5mM。结合第三方面或上述某些可能的实施方式，在第三方面的一种可能的实现方式中，所述步骤(b)中，反应体系中脱氧核糖核苷三磷酸最终浓度为0.25mM。结合第三方面或上述某些可能的实施方式，在第三方面的一种可能的实现方式中，所述步骤(b)中，双重PCR扩增的反应条件包括：94℃，预变性5min；94℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸1min50s，循环40次；72℃延伸10min；4℃，保存。在上述反应体系及反应条件下，检测荧光假单胞菌的方法中双重PCR的扩增效率更高，从而使检测效果更好。结合第三方面或上述某些可能的实施方式，在第三方面的一种可能的实现方式中，所述步骤(c)中产物电泳检测到长度为1.47kb的条带和/或长度为0.75kb的条带。上述技术方案中，通过设计了一组(两对)用于扩增荧光假单胞菌基因的双重PCR引物，可以特异性地扩增出荧光假单胞菌中的adnA基因片段和/或fliC基因片段，而对于其他种类的假单胞菌，则无法扩增出adnA基因片段和fliC基因片段，对于无生物膜形成能力的荧光假单胞菌，也无法扩增出adnA基因片段和fliC基因片段。因此，将第一引物对和第二引物对共同用于进行双重PCR来扩增待测菌株的adnA基因片段和/或fliC基因片段，通过检测adnA基因片段或fliC基因片段是否存在，就可以判断是否存在具有生物膜形成能力的荧光假单胞菌。采用第一引物对和第二引物对进行双重PCR，一次实验操作可以同时得到两段基因片段的扩增产物，进而实现双靶点检测，相比于单一靶点检测方法而言提高了检测结果的可靠性，降低了漏检率，同时也没有增加检测时间，与逐一检测靶点的方法相比还降低了检测费用，提高了检测效率。采用该方法操作简单，能够快速有效地检测具有生物膜形成能力的荧光假单胞菌。附图说明图1为本专利技术所提供的第一个实施例的电泳结果。图2为本专利技术所提供的第二个实施例的电泳结果。具体实施方式为更清楚的对本专利技术技术方案予以阐述，下面将结合实施例对本专利技术的技术方案进行进一步阐述。adnA基因是负责荧光假单胞菌生物膜形成的调控基因，此前，专利技术人开发了一种检测荧光假单胞菌的检测方法，通过设计一对扩增adnA基因的引物，进行单重PCR来检测，由于检测靶点单一，可能存在漏检的情况。为此，专利技术人经过创造性劳动，提供一种改进方案，通过设计另一对扩增fliC基因的引物，fliC基因是负责荧光假单胞菌鞭毛生物合成的基因，adnA基因和fliC基因都是负责荧光假单胞菌生物膜形成的关键基因，将两对引物一起进行双重PCR来检测具有生物膜形成能力的荧光假单胞菌，从而大大减少了漏检的情况。具体地，设计的双重PCR引物包括用于扩增荧光假单胞菌adnA基因的第一引物对，及用于扩增荧光假单胞菌fliC基因的第二引物对；第一引物对：adnA-for：5’-ATGTGGCGTGAAACCAAAAT-3’，adnA-rev：5’-TCAATCATCCGCCTGTTCA-3’；第二引物对：fliC-for：5’-GATGCAGCGCCTGTCTTC-3’，fliC-rev：5’-TCAGTACAGCGGAAGGCA-3’。双重PCR和单重PCR相比，由于引物的增多，会导致引物二聚体以及非特异性扩增的概率增多，因此，引物的设计十分重要。通过上述的两对引物对，从而实现同时特异性扩增adnA基因和fliC基因，提高了荧光假单胞菌的检测结果的可靠性，降低了漏检率，同时也没有增加检测时间，与逐一检测靶点的方法相比还降低了检测费用，提高了检测效率。进一步地，通过优化双重PCR的条件，使得检测方法中两对引物对与反应体系中各组分的浓度、反应条件等相互配合，进一步减少引物二聚体和非特异性扩增。例如，通过优化退火温度，确保同一个退火温度下更好地实现两个PCR反应，从而进一步的增强引物PCR的特异性，减少非特异性扩增，得到特异性更强的条带。以下实施例中涉及的菌种有荧光假单胞菌1035，M73，M55，M45，1044、1034、N25和D64，恶臭假单胞菌菌株796，莓实假单胞菌菌株M66、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一组用于扩增荧光假单胞菌基因的双重PCR引物，其特征在于，双重PCR引物包括用于扩增荧光假单胞菌adnA基因的第一引物对，及用于扩增荧光假单胞菌fliC基因的第二引物对；第一引物对：adnA‑for：5’‑ATGTGGCGTGAAACCAAAAT‑3’，adnA‑rev：5’‑TCAATCATCCGCCTGTTCA‑3’；第二引物对：fliC‑for：5’‑GATGCAGCGCCTGTCTTC‑3’，fliC‑rev：5’‑TCAGTACAGCGGAAGGCA‑3’。

【技术特征摘要】
1.一组用于扩增荧光假单胞菌基因的双重PCR引物，其特征在于，双重PCR引物包括用于扩增荧光假单胞菌adnA基因的第一引物对，及用于扩增荧光假单胞菌fliC基因的第二引物对；第一引物对：adnA-for：5’-ATGTGGCGTGAAACCAAAAT-3’，adnA-rev：5’-TCAATCATCCGCCTGTTCA-3’；第二引物对：fliC-for：5’-GATGCAGCGCCTGTCTTC-3’，fliC-rev：5’-TCAGTACAGCGGAAGGCA-3’。2.一种检测荧光假单胞菌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的第一引物对和第二引物对、PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸和Taq酶。3.一种检测荧光假单胞菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：(a)提取待测菌株的基因组DNA，获得模板DNA；(b)进行双重PCR反应，双重PCR反应体系包括：权利要求1所述的第一引物对和和第二引物对、PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、Taq酶、模板DNA以及ddH2O；(c)将步骤(b)反应得到的产物进行电泳。4.根据权利要求3所述的检测荧光假单胞菌的方法，其特征在于，所述步骤(b)中，反应体系中第...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐煜，游春苹，刘振民，黄彧昊，
申请(专利权)人：光明乳业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31