菲律宾蛤仔高活性抗肿瘤肽的制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了菲律宾蛤仔高活性抗肿瘤肽的制备方法，包括酶解、超滤、强阳离子交换柱色谱分离、凝胶柱色谱分离等步骤，且公开了上述制备方法得到的菲律宾蛤仔抗肿瘤肽在抑制A549非小肺癌上的应用。本发明专利技术采用最佳酶解与纯化工艺制备菲律宾蛤仔抗肿瘤肽，超滤获得分子量小于5 KDa的组分并经两步分离纯化，获取得到高活性多肽，整体工艺简单，易于推广应用。

【技术实现步骤摘要】
菲律宾蛤仔高活性抗肿瘤肽的制备方法及应用
本专利技术涉及水产加工利用
，尤其是涉及一种菲律宾蛤仔抗肿瘤肽的制备方法及应用。
技术介绍
生物活性肽是蛋白序列内不活动的特定蛋白质片段，这个特定蛋白质片段可通过胃肠消化或食品加工从亲本蛋白中释放出来，并表现出多种生物功能活性，在机体生命活动中起着重要作用。生物活性肽是由两个或两个以上氨基酸缩合而成的，一般具有2～20个氨基酸残基，分子量一般小于6KDa。生物活性肽的结构特性(氨基酸组成及序列)影响活性肽的活性，使得生物活性肽表现出多种生物活性，例如抗氧化、抗肿瘤、抗高血压、抑菌和抗凝血等。我国海洋贝类种类丰富，产量居世界之首，2014年产量达1341.67×104t。海洋贝类肉质肥嫩，鲜美可口，含有大量的蛋白质、氨基酸、多糖等营养物质，是一种经济价值极高的海洋生物。大多数情况下，海洋贝类仅仅被加工成食品，品种单一，产品附加值低。运用酶解技术从海洋贝类或其加工副产物中提取具有生物功能活性的多肽，高值化利用海洋贝类资源，可获得更好的经济效益。近年来，从海洋贝类中获取生物活性肽的研究受到了广泛关注。菲律宾蛤仔(Ruditapesphilippinarum)，俗称杂色蛤，广泛分布于我国沿海地区，是我国四大养殖贝类之一，富含蛋白质、脂肪、多糖和人体必需的微量元素，是一种经济价值极高的海洋贝类。已有研究表明，菲律宾蛤仔提取物具有多种生物活性。近年来有关菲律宾蛤仔提取物的研究主要集中于抗氧化、增强免疫力和降血压等方面，而对抗肿瘤的研究较少。我所于2016年10月公开了“利用酶法制备菲律宾蛤仔抗肿瘤肽的研究”(《渔业现代化》第43卷第5期)，通过研究采用酶解技术获取菲律宾蛤仔多肽，获取得到的多肽产物仅在体外对A549的抑制率高，但是纯度及活性不高，而只有活性的肽才能对人体体内产生很好的效果，因此有必要进行进一步的研究开发，提高菲律宾蛤仔抗肿瘤肽的活性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种菲律宾蛤仔抗肿瘤肽的制备方法，以获取高活性多肽。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：菲律宾蛤仔高活性抗肿瘤肽的制备方法，包括以下步骤：S1.酶解，取新鲜菲律宾蛤仔，海水吐沙后，放入冰箱冷冻后，开壳取肉，匀浆，料液比1:1，调节pH值2.0，添加胃蛋白酶，加酶量为500～3000U/g，酶解温度31～43℃，酶解时间2～12h，灭酶后离心，取上层清液；S2.超滤，将步骤S1得到的上层清液进行超滤截留，收集分子量5KDa以下的截留液，纳滤浓缩脱盐，冷冻干燥；S3.强阳离子交换柱色谱分离，步骤S2中冷冻干燥的产物通过强阳离子交换柱，缓冲液线性洗脱后，在紫外-可见分光光度计280nm处进行检测，分别收集各洗脱峰，透析除盐，冷冻干燥；将干燥后的各组分进行抗肿瘤活性分析，进一步确定目标肽所在的洗脱峰，并对该洗脱组分大量收集，冷冻干燥；S4.凝胶柱色谱分离，将步骤S3中冷冻干燥后的产物过凝胶柱洗脱，然后在紫外-可见分光光度计280nm处进行检测，分别收集各洗脱峰，透析除盐，冷冻干燥，将干燥后的各组分进行抗肿瘤活性分析，进一步确定目标肽所在的洗脱峰，并对该洗脱组分大量收集，冷冻干燥即得菲律宾蛤仔高活性抗肿瘤肽。其中，步骤S3中采用SPSephadexC-25强阳离子交换柱，缓冲液为含浓度小于等于1mol/LNaCl的乙酸纳-乙酸缓冲液进行线性洗脱，洗脱速度为0.5～1.5mL/min。其中，步骤S4中采用SephadexG-25凝胶柱，流动相为超纯水进行洗脱，洗脱速度为0.5～1.5mL/min。优选地，步骤S3及S4中抗肿瘤活性分析采用CCK-8法。优选地，步骤S1中胃蛋白酶的加酶量为1000U/g，酶解温度为37℃，酶解时间为6h。本专利技术还公开了上述菲律宾蛤仔高活性抗肿瘤肽的制备方法得到的菲律宾蛤仔抗肿瘤肽在抑制A549非小肺癌上的应用。本专利技术具有如下有益效果：采用最佳酶解与纯化工艺制备菲律宾蛤仔抗肿瘤肽，超滤获得分子量小于5KDa的组分并经两步分离纯化，获取可得到高活性多肽。将所得的目标肽应用于A549非小肺癌细胞上产生了很强的细胞增殖抑制作用，并验证了分子量5KDa以下的超滤截留组分在A549荷瘤小鼠上产生了很强的肿瘤抑制作用，为菲律宾蛤仔抗肿瘤肽制备研究提供试验依据；本专利技术整体工艺简单，投入较少，易于推广应用。附图说明图1为五种蛋白酶的酶解产物对A549非小肺癌细胞增殖抑制率的柱状图。图2为胃蛋白酶不同分子量酶解产物对A549非小肺癌细胞增殖抑制率的柱状图。图3为胃蛋白酶酶解产物分子量5k以下的组分的SPSephadexC-25层析图谱。图4为SPSephadexC-25强阳离子交换柱分离组分对A549非小肺癌细胞增殖半抑制浓度(IC50)的柱状图。图5为图3中峰Ⅳ的SephadexG-25凝胶层析图谱。图6为SephadexG-25凝胶柱分离组分对A549非小肺癌细胞增殖半抑制浓度(IC50)的柱状图。图7为各组小鼠的抑瘤率柱状图。具体实施方式为了使本领域的技术人员更好地理解本专利技术的技术方案，下面结合附图及具体实施例对本专利技术作进一步详细的描述。本实施例公开了菲律宾蛤仔高活性抗肿瘤肽的制备分析过程，及将制备得到的产物进行小鼠动物实验的过程，具体如下：1、材料准备(1)动物：菲律宾蛤仔购自某超市，吐沙1d，洗净、去壳、取肉、匀浆，－20℃保存备用；SPF级Balb/c-nu级裸小鼠，雌雄各半，12～15g，4～5周龄，40只，广东省医学试验动物中心提供。(2)细胞株：A549非小肺癌细胞购于中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心。(3)主要试剂：胃蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶均购自南宁庞博生物工程有限公司；SPSephadexC-25强阳离子交换柱与葡聚糖凝胶SephadexG-25均购自美国GE公司；McCoys5A培养基、胎牛血清均购自美国Gibco公司；青霉素-链霉素溶液购自美国Hyclone公司；CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所；其余试剂均为分析纯。(4)主要仪器：5804R高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；HH－6数显恒温水浴锅，常州国华电器有限公司；PB－10pH计、电子分析天平，德国Sartorius公司；Gl54-DWS高压灭菌锅，美国Zealway公司；ClassIITypeB2型生物安全柜，德国ESCO公司；BPN－80CRH二氧化碳培养箱，昆山一恒仪器有限公司；InfiniteM200RQ酶标仪，瑞士NanoQuant公司；XDS－IA倒置生物显微镜，上海精密仪器仪表有限公司。2、制备试验过程(1)酶解工艺流程：选用胃蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶5种蛋白酶分别对菲律宾蛤仔肉进行酶解，各种蛋白酶的酶解条件见表1，酶解过程依次如下：称取一定量的菲律宾蛤仔匀浆液，加入等体积的蒸馏水(料液比1:1)，0.5mol/LNaOH或0.5mol/LHCl溶液调pH值，加酶在各自最适温度及pH条件下水解，沸水浴灭酶10min，离心(8000r/min，5min)，取上清液，冷冻干燥，CCK-8法初步测定酶解产物的抗肿瘤活性。表1几种蛋白酶的酶解条件酶种类PH温度/℃加酶量/(U/g)酶解时间/h胃蛋白酶(本文档来自技高网...

【技术保护点】
菲律宾蛤仔高活性抗肿瘤肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.酶解，取新鲜菲律宾蛤仔，海水吐沙后，放入冰箱冷冻后，开壳取肉，匀浆，料液比1:1，调节pH值2.0，添加胃蛋白酶，加酶量为500～3000U/g，酶解温度31～43℃，酶解时间2～12 h，灭酶后离心，取上层清液；S2.超滤，将步骤S1得到的上层清液进行超滤截留，收集分子量5KDa 以下的截留液，纳滤浓缩脱盐，冷冻干燥；S3.强阳离子交换柱色谱分离，步骤S2中冷冻干燥的产物通过强阳离子交换柱，缓冲液线性洗脱后，在紫外‑可见分光光度计280nm处进行检测，分别收集各洗脱峰，透析除盐，冷冻干燥；将干燥后的各组分进行抗肿瘤活性分析，进一步确定目标肽所在的洗脱峰，并对该洗脱组分大量收集，冷冻干燥；S4.凝胶柱色谱分离，将步骤S3中冷冻干燥后的产物过凝胶柱洗脱，然后在紫外‑可见分光光度计280nm处进行检测，分别收集各洗脱峰，透析除盐，冷冻干燥，将干燥后的各组分进行抗肿瘤活性分析，进一步确定目标肽所在的洗脱峰，并对该洗脱组分大量收集，冷冻干燥即得菲律宾蛤仔高活性抗肿瘤肽。

【技术特征摘要】
1.菲律宾蛤仔高活性抗肿瘤肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.酶解，取新鲜菲律宾蛤仔，海水吐沙后，放入冰箱冷冻后，开壳取肉，匀浆，料液比1:1，调节pH值2.0，添加胃蛋白酶，加酶量为500～3000U/g，酶解温度31～43℃，酶解时间2～12h，灭酶后离心，取上层清液；S2.超滤，将步骤S1得到的上层清液进行超滤截留，收集分子量5KDa以下的截留液，纳滤浓缩脱盐，冷冻干燥；S3.强阳离子交换柱色谱分离，步骤S2中冷冻干燥的产物通过强阳离子交换柱，缓冲液线性洗脱后，在紫外-可见分光光度计280nm处进行检测，分别收集各洗脱峰，透析除盐，冷冻干燥；将干燥后的各组分进行抗肿瘤活性分析，进一步确定目标肽所在的洗脱峰，并对该洗脱组分大量收集，冷冻干燥；S4.凝胶柱色谱分离，将步骤S3中冷冻干燥后的产物过凝胶柱洗脱，然后在紫外-可见分光光度计280nm处进行检测，分别收集各洗脱峰，透析除盐，冷冻干燥，将干燥后的各组分进行抗肿瘤活性分析，进一步确定目标肽所在的...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘智禹，蔡康鹏，吴靖娜，蔡水淋，
申请(专利权)人：福建省水产研究所，
类型：发明
国别省市：福建,35