一种穿心莲内酯‑19‑O‑葡萄糖苷及其制备方法和在制备抗炎药物中的应用技术

本发明专利技术属于生物催化剂生物合成技术领域，公开了一种穿心莲内酯‑19‑O‑葡萄糖苷及其制备方法和在制备抗炎药物中的应用。本发明专利技术方法具体为缓冲溶液体系中，以尿苷‑5'‑二磷酸葡萄糖二钠盐为糖基供体，运用糖基转移酶OleD的突变体A242V/S132F/P67T催化穿心莲内酯进行糖基化反应，得到穿心莲内酯‑19‑O‑葡萄糖苷。本发明专利技术方法得到的穿心莲内酯‑19‑O‑葡萄糖苷可应用于制备抗炎药物中，其经过糖基化处理，大大增加药物的水溶性，改善药物原有的抗炎活性。本发明专利技术首次采用糖基转移酶对穿心莲内酯进行糖基化修饰，该反应体系中反应条件温和、能耗少、产率高、立体和区域选择性好、副产品少以及产物易分离等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种穿心莲内酯-19-O-葡萄糖苷及其制备方法和在制备抗炎药物中的应用
本专利技术属于生物催化剂生物合成
，特别涉及一种穿心莲内酯-19-O-葡萄糖苷及其制备方法和在制备抗炎药物中的应用。
技术介绍
穿心莲内酯(andrographolide)为爵床科植物穿心莲中的二萜内酯类化合物，是中药穿心莲的主要有效成分之一(N.Pholphana；N.Rangkadilok；S.Thongnest；S.Ruchirawat；M.Ruchirawat；J.Satayavivad；DeterminationandvariationofthreeactivediterpenoidsinAndrographispaniculata(Burm.f.)Nees,Phytochem.Anal.15(2004)365–371.)。穿心莲内酯主要存在于叶子中(大约0.5～1.0％)，具有较好的抗菌、抗炎、抗病毒等功能。由于穿心莲内酯在水中的最大溶解度仅为60μg/mL，同时也难溶于大多数有机溶剂中，因而限制其应用及结构修饰。糖基化修饰是增强水溶性和药理活性的重要方法(F.J.Li；H.Maag；T.Alfredson；Prodrugsofnucleosideanaloguesforimprovedoralabsorptionandtissuetargeting；J.Pharm.Sci.97(2008)1109–1134.)。穿心莲内酯-19-O-葡萄糖苷也存在于穿心莲中，但含量极低。通过对穿心莲内酯结构进行糖基化改造，是寻找水溶性好、活性更强的穿心莲内酯衍生物的有效方法。目前，主要有两种方法合成穿心莲内酯-19-O-葡萄糖苷，一种是用化学方法(王秀萍；穿心莲内酯糖苷衍生物的合成；中国药师,2005,8(6):406-408)。这种方法合成穿心莲内酯-19-O-葡萄糖苷，能耗大、立体和区域选择性差、易产生副产物；并且由于反应过程中使用大量有毒有机溶剂和催化剂，一方面会带来较严重的环境污染问题，另一方面产物中常残留一些有毒的化学物质而存在安全隐患。另外一种是生物合成法制备穿心莲内酯-19-O-葡萄糖苷(YingQiao；YaoHuang；FangFeng；Zhi-GangChen；Efficientenzymaticsynthesisandantibacterialactivityofandrographolideglycoside；ProcessBiochemistry51(2016)675–680)，这种方法在目前文献报到了穿心莲内酯-19-O-半乳糖苷的合成，产率较低(大约25.5～67.5％)。OleD是链霉菌属的一种糖基转移酶，其天然底物是竹桃霉素、红霉素和泰乐菌素，能够将葡萄糖从UDP-葡萄糖转移到这些大环内酯类抗生素的去氧糖胺结构的2-OH位置，将其糖基化，该过程在链霉菌的自我保护机制中发挥着重要作用(Williams,GavinJ；Zhang,Changsheng；Thorson,JonS；Expandingthepromiscuityofanatural-productglycosyltransferasebydirectedevolution；NatChemBiol,2007,3,657-662)。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的缺点与不足，本专利技术的首要目的在于提供一种穿心莲内酯-19-O-葡萄糖苷的制备方法。本专利技术另一目的在于提供上述方法制备的穿心莲内酯-19-O-葡萄糖苷。本专利技术再一目的在于提供上述穿心莲内酯-19-O-葡萄糖苷在制备抗炎药物中的应用。本专利技术的目的通过下述方案实现：一种穿心莲内酯-19-O-葡萄糖苷的制备方法，具体为缓冲溶液体系中，以尿苷-5'-二磷酸葡萄糖二钠盐(UDPG)为糖基供体，运用糖基转移酶OleD的突变体A242V/S132F/P67T(ASP)催化穿心莲内酯进行糖基化反应，得到穿心莲内酯-19-O-葡萄糖苷。所用穿心莲内酯与糖基转移酶OleD的突变体ASP的质量比为1.75:0.1～1.75:6，优选为1.75:2。所用穿心莲内酯与尿苷-5'-二磷酸葡萄糖二钠盐(UDPG)的摩尔比为0.05:1～0.8:1，优选为0.1:1。所述缓冲溶液体系优选为50mMpH6.0～10.0的Tris-HCl的缓冲体系，更优选为50mMpH8.0的Tris-HCl的缓冲体系。所述缓冲溶液体系中还含有5mM的MgCl2。所述糖基化反应优选在20～45℃下进行，更优选为37℃。所述反应的时间优选为8～24h，更优选为16h。所述反应后体系，通过添加等体积的甲醇终止反应，再离心、过大孔树脂柱洗脱得到纯化的穿心莲内酯-19-O-葡萄糖苷。所述离心优选为在12000rpm离心15min，得到上清液。所述洗脱先用纯水洗脱去掉水溶性杂质，再用50％的乙醇洗脱，得到产物。本专利技术还提供上述方法制备的穿心莲内酯-19-O-葡萄糖苷。本专利技术的穿心莲内酯-19-O-葡萄糖苷可应用于制备抗炎药物中，其经过糖基化处理，大大增加了药物的水溶性，改善了药物原有的抗炎活性。所述的药物含有本专利技术的穿心莲内酯-19-O-葡萄糖苷、其药用盐及其溶剂化物中的至少一种。所述的药物含有一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂，所述的赋形剂包括稀释剂、湿润剂、润滑剂、填充剂和防腐剂中的至少一种。所述的药物采用本领域的常规方法制备成各种剂型，包括胶囊、丸剂、片剂、口服液、颗粒剂、酊剂的剂型及注射液。本专利技术首次采用糖基转移酶对穿心莲内酯进行糖基化修饰，该反应体系中反应条件温和、能耗少、产率高、立体和区域选择性好、副产品少以及产物易分离等优点。同时由于采用生物酶为催化剂，反应过程中没有类似化学合成中的诸多基团保护-脱保护的步骤，保证了酶催化穿心莲内酯糖基化过程对环境友好，更绿色环保，产品质量更放心。本专利技术相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：1、本专利技术采用糖基转移酶催化穿心莲内酯葡萄糖苷化合物的生物转化，可实现穿心莲内酯葡萄糖苷化合物的产率高达99％，相比其他的酶催化，大大提高了目标产物的产率。2、本专利技术方法将穿心莲内酯进行糖基化后，大大的增加了药物的水溶性，并且增强了药物原有的抗炎的活性，具有良好的药用前景。3、本专利技术方法采用糖基转移酶法合成穿心莲内酯葡萄糖苷，酶催化反应具有高度选择性，因而产物穿心莲内酯糖苷的纯度高，纯化容易；克服了传统化学方法的立体和区域选择性低，因而副产物多的缺点。4、由于本专利技术方法采用糖基转移酶作为催化剂，克服了传统化学方法使用大量有毒有害的金属盐作为催化剂的缺点，同时反应过程中没有类似化学合成中的诸多基团保护-脱保护的步骤，时间短，且使得糖基化过程更绿色环保。附图说明图1为穿心莲内酯葡萄糖苷的生物合成路线图。图2为穿心莲内酯及其葡萄糖苷的HPLC分析图。图3为穿心莲内酯葡萄糖苷的质谱图。图4为穿心莲内酯葡萄糖苷的1HNMR核磁图谱。图5为穿心莲内酯葡萄糖苷的13CNMR核磁图谱。图6为穿心莲内酯葡萄糖苷的转化率随酶浓度变化。图7为穿心莲内酯葡萄糖苷的转化率随糖供体量变化。图8为穿心莲内酯葡萄糖苷的转化率随pH值变化。图9为诱导产生NO的活性测定。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步详细的描述，但本本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种穿心莲内酯‑19‑O‑葡萄糖苷的制备方法，其特征在于具体为缓冲溶液体系中，以尿苷‑5'‑二磷酸葡萄糖二钠盐为糖基供体，运用糖基转移酶OleD的突变体A242V/S132F/P67T催化穿心莲内酯进行糖基化反应，得到穿心莲内酯‑19‑O‑葡萄糖苷。

【技术特征摘要】
1.一种穿心莲内酯-19-O-葡萄糖苷的制备方法，其特征在于具体为缓冲溶液体系中，以尿苷-5'-二磷酸葡萄糖二钠盐为糖基供体，运用糖基转移酶OleD的突变体A242V/S132F/P67T催化穿心莲内酯进行糖基化反应，得到穿心莲内酯-19-O-葡萄糖苷。2.根据权利要求1所述的穿心莲内酯-19-O-葡萄糖苷的制备方法，其特征在于：所用穿心莲内酯与糖基转移酶OleD的突变体A242V/S132F/P67T的质量比为1.75:0.1～1.75:6；所用穿心莲内酯与尿苷-5'-二磷酸葡萄糖二钠盐的摩尔比为0.05:1～0.8:1。3.根据权利要求1所述的穿心莲内酯-19-O-葡萄糖苷的制备方法，其特征在于：所用穿心莲内酯与糖基转移酶OleD的突变体A242V/S132F/P67T的质量比为1.75:2；所用穿心莲内酯与尿苷-5'-二磷酸葡萄糖二钠盐的摩尔比为0.1:1。4.根据权利要求1所述的穿心莲内酯-19-O-葡萄糖苷的制备方法，其特征在于：所述缓冲溶液体系为50mMpH...

【专利技术属性】
技术研发人员：江仁望，朱雪林，文超，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东,44