棉花转基因创制细胞质雄性不育系的方法技术

本发明专利技术提供一种棉花转基因创制细胞质雄性不育系的方法。采用转基因方法获得细胞质雄性不育种质，继而与同源或异源保持系进行核置换回交，选育出质核同源和异源的雄性不育系。按照本发明专利技术方法选育的细胞质雄性不育系所用的外源基因为非全长Hcpdil5‑2a，来源于锦葵科木槿属植物红麻。由此选育的细胞质雄性不育系是由转基因雄性不育种质与非转基因的同源或异源保持系(或品种/系)进行核置换回交而成，因而其细胞核为非转基因，不含转基因质粒载体，与非转基因植物无异，不存在安全风险和市场风险；同时也极大地丰富了棉花雄性不育细胞质的遗传多样性，具有极为广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
棉花转基因创制细胞质雄性不育系的方法
本专利技术涉及生物技术和植物育种
，具体地说，涉及一种棉花转基因创制细胞质雄性不育系的方法。
技术介绍
棉花，锦葵科棉属，是世界上最主要的农作物之一。它既是最重要的纤维作物，又是重要的油料作物，也是含高蛋白的粮食作物，还是纺织、精细化工原料和重要的战略物资。棉花表现出强大的杂种优势，其杂种优势率高达20％-30％。长期以来，棉花杂种优势利用是国内外棉花育种的重要内容。棉花既可利用细胞核雄性不育系、也可利用细胞质雄性不育系生产杂交种子。虽然细胞核雄性不育系的利用易于找到恢复系和组配出强优势杂交组合，但不育系的繁殖存在问题，一般利用细胞核雄性不育两用系中分离出的雄性不育株(基因型为msms)与育性基因杂合的可育姊妹株(基因型为Msms)杂交的方法保持，从不育株上收的种子繁殖后代仍然表现不育株与可育株的1：1分离，因此，杂交制种田必须每年拔除母本区50％左右的雄性可育株，工作量集中，劳动强度大；且因群体中可育株与不育株分布的不均匀性，往往存在连续拔除多株可育株的问题，既浪费了土地空间，又增加了种子生产成本。为解决此问题，四川省农业科学院经济作物育种栽培研究所和四川诺亚生物科技有限公司，根据棉花在热带地区的多年生特性，于2007年申请了1项国家专利技术专利，专利技术名称为“利用棉花雄性不育系和恢复系进行宿根再生的杂交制种方法”(申请号：200710049843.0)。该专利技术公开了棉花植株能够越冬的制种区是冬季最低温度≥10℃，年日照时数1700-2100小时，日照百分率为50-60％，全年降雨量为800-1200mm的地区。从温度条件看，应属于中热带地区(盛承禹等编著.中国气候总论.科学出版社，1986，第406页)，但热带有旱季和雨季之分，雨季多台风，不利于棉花的杂交制种，所以，又要求其降雨量小于1200mm。因此，满足上述所有条件的地区是很少的，可能只有云南或云南与四川交界的部分地区具有这种小气候特征，而这些地区，大多比较偏远，交通不便，不利于棉花的规模化杂交制种。而且，该专利技术还没有解决不育系的繁殖问题，只是利用了不育系在热带地区可多年生长的特性。但由于一年生棉花根系入土浅，易早衰，就是在最适合生长的温度条件下一般也只能宿根栽培2-3年，又需要重新播种。为解决棉花的宿生栽培问题，广西大学周瑞阳课题组研发了“一年生棉花的多年生杂交制种方法”(ZL200910078533.0)。其首先鉴定一年生棉花杂交亲本的自然越冬能力；对于不能自然越冬的一年生棉花杂交亲本，以棉属中能够自然越冬的多年生棉花种质资源为砧木进行嫁接，并宿根栽培所得嫁接植株；对于能够自然越冬的一年生棉花杂交亲本，直接种植并宿根栽培其实生植株，或以上述方法嫁接后宿根栽培；然后利用上述实生植株和/或嫁接植株进行杂交制种。本专利技术的杂交制种方法不需每年播种，不需每年耕整土地，不需每年去杂去劣，降低了雄性不育系的繁殖成本，简化了杂交种子生产程序，并可提高杂交制种的产量。但该专利技术存在嫁接大量用工的问题，且只能在华南南部实现多年生栽培，存在地域限制。利用细胞质雄性不育系与保持系回交的方法虽能保持雄性不育特性，但前人选育细胞质雄性不育系多数具哈克尼西棉细胞质，其恢复系较少，且恢复系和杂交种对高温敏感，在夏季的高温条件下，恢复系和杂交种散粉困难，表现为半不育现象，难以在生产上大面积推广应用。因此，尽管人工去雄存在投入大、成本高等问题，但由于没有更好的棉花杂交种子生产方法，几年前仍以人工去雄杂交制种为主，为降低种子生产成本，一般利用F2代。但由于劳动力成本的不断上升，棉花杂交种子生产企业已不堪重负，生产上已基本没有棉花杂交种推广应用。在农业生产中，由单一细胞质雄性不育系组配的杂交种在生产中的大面积推广和长期利用可能成为某一病害生理小种的哺育品种，从而存在某一病害大流行的风险。解决这一问题的基本途径是获得多种细胞质来源的雄性不育系，而不同细胞质来源的雄性不育系的选育源于细胞质雄性不育种质的遗传多样性。但迄今为止，植物细胞质雄性不育种质一般源于自然突变或采用远缘杂交的方法获得，而自然突变几率很低，远缘杂交又难以成功，因此，许多作物因雄性不育种质的缺乏至今尚未选育出细胞质雄性不育系。若能采用转雄性不育相关基因的方法创造细胞质雄性不育种质将具有极重要的科学意义和广阔的利用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有棉花细胞质雄性不育种质创新方法的缺陷，提供一种棉花转基因创制细胞质雄性不育系的方法。本专利技术人长期致力于植物雄性不育种质创新及其分子基础的研究工作。2008年，由周瑞阳教授指导的博士研究生李刚采用同重标签相对定量与绝对定量(简称iTRAQ)技术分析了红麻雄性不育系和保持系花药线粒体蛋白质组差异，发现了一个差异表达的PDIL(proteindisulfideisomerase-like，类蛋白质二硫键异构酶，缩写为“PDIL”)蛋白。该蛋白质部分氨基酸残基的同源序列比对结果表明，其与AtPDIL5-2、OsPDIL5-2和OsPDIL5-3直系同源。2010年，由周瑞阳教授指导的另一位博士研究生金刚在此基础上，根据GenBank中公布的OsPDIL5-2、OsPDIL5-3、AtPDIL5-2及其他同源基因的cDNA序列，基于同源克隆和RACE技术，克隆了两个红麻PDIL同源基因，并通过全长cDNA的扩增加以验证。两个基因分别命名为Hcpdil5-2a和Hcpdil5-2b，在NCBI基因数据库中的登录号分别为HQ638208和HQ898859。同时，这两个基因在不育系开花期的不同组织器官的表达量存在差异，其中Hcpdil5-2a在各组织的表达均受到不育胞质的影响，而其Hcpdil5-2b的表达仅在营养器官中受到不育胞质的影响。说明Hcpdil-2a可能与雄性不育有关。然而，与雄性不育相关基因的发现，与细胞质雄性不育系的创制是两个截然不同的问题。经过多年研究，本专利技术人采用花粉管通道法转红麻非全长Hcpdil5-2a基因，成功创造出了棉花细胞质雄性不育种质，继而转育成棉花细胞质雄性不育系。为了实现本专利技术目的，本专利技术首先提供红麻Hcpdil5-2a基因非全长CDS序列在创制植物细胞质雄性不育系中的应用。其中，所述红麻Hcpdil5-2a基因非全长CDS序列为：i)SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；或ii)SEQIDNO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或iii)在严格条件下与SEQIDNO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。本专利技术还提供一种基因表达盒，其包含红麻Hcpdil5-2a基因非全长CDS序列。本专利技术还提供含有上述表达盒的载体。本专利技术还提供含有上述表达盒或携带有该表达盒的载体的工程菌、宿主细胞及转基因细胞系。本专利技术进一步提供一种棉花转基因创制细胞质雄性不育系的方法，包括以下步骤：S1、重组表达载体PBI121-Hcpdil5-2a-本文档来自技高网...

【技术保护点】
红麻Hcpdil5‑2a基因非全长CDS序列在创制植物细胞质雄性不育系中的应用，其中，所述红麻Hcpdil5‑2a基因非全长CDS序列为：i)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或ii)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或iii)在严格条件下与SEQ ID NO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.红麻Hcpdil5-2a基因非全长CDS序列在创制植物细胞质雄性不育系中的应用，其中，所述红麻Hcpdil5-2a基因非全长CDS序列为：i)SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；或ii)SEQIDNO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或iii)在严格条件下与SEQIDNO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。2.一种基因表达盒，其特征在于，包含红麻Hcpdil5-2a基因非全长CDS序列。3.含有权利要求2所述表达盒的载体。4.含有权利要求2所述表达盒或权利要求3所述载体的工程菌。5.棉花转基因创制细胞质雄性不育系的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、重组表达载体PBI121-Hcpdil5-2a-GFP的构建将从红麻中克隆获得的Hcpdil5-2a基因非全长CDS序列插入到PBI121-GFP载体的XbaI和KpnI酶切位点之间，即构建得到重组表达载体PBI121-Hcpdil5-2a-GFP；S2、转基因棉花植株的构建采用花粉管通道法将重组表达载体PBI121-Hcpdil5-2a-GFP导入棉花植株中，收获转基因棉花植株的T0代种子；S3、转基因棉花细胞质雄性不育种质资源的获得播种上述T0代种子获得T1代植株，于开花期调查T1代植株育性，选择雄性不育株；对于没有发现雄性不育株的群体，采用“一粒传”混合选择法于每株收获1～2个自交果实即为T1代种子；播种T1代单株种子获得T2代株系，选择雄性不育株；将上述选出的雄性不育株作为棉花细胞质雄性不育种质资源；S4、棉花转基因细胞质雄性不育系的选育(1)转基因质核同源细胞质雄性不育系的选育方法之一：以上述转基因雄性不育种质资源为母本，以其野生型非转基因品种或品系回交，成熟期收获T1代种子，然后播种，观察T2代植株育性，如果仍表现为雄性不育，表明其为细胞质遗传的雄性不育...

【专利技术属性】
技术研发人员：周瑞阳，刘冬梅，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：广西,45