一种定点突变创制玉米紧凑株型种质的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种定点突变创制玉米紧凑株型种质的方法及其应用。本发明专利技术的培育紧凑株型玉米的方法，包括向目的玉米中导入玉米基因组编辑的载体，得到紧凑株型玉米，紧凑株型玉米与目的玉米相比，叶夹角变小；玉米基因组编辑的载体含有Cas9蛋白基因、sgRNA编码基因和RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子。采用本发明专利技术的方法能够实现对玉米的基因编辑，获得具有直立性状的紧凑型玉米，具有很高的育种和栽培价值。

【技术实现步骤摘要】
一种定点突变创制玉米紧凑株型种质的方法及其应用
本专利技术涉及基因工程领域中一种定点突变创制玉米紧凑株型种质的方法及其应用。
技术介绍
玉米(ZeamaysL.)是世界上重要的三大粮食作物之一，产量需要不断增长以满足当前和未来日益增长的需求。种植密度是影响单位面积产量的重要因素，数十年的玉米产量数据表明，种植密度的增加对总产量增长的贡献远高于单株产量的增加。因此，提高玉米单位面积的种植密度是提高总产量的可行方法之一(Brekkeetal.,2011)。玉米无叶舌性状能使叶片直立、叶基角变小、光合面积变大、光能利用率提高，对发展耐密种植模式和提高群体产量都具有重要作用。单位面积的光捕获量与产量密切相关，而叶片直立玉米具有更高的种植密度和单位面积上更多的光捕获量(LambertandJohnson,1978)，在水稻中也有同样的发现(SinclairandSheehy,1999)。叶片直立性状在玉米杂交种发展的文献中已有大量报道(Duvick,2005；Hammeretal.,2009)。因此，叶片直立性状有着很高的育种和栽培价值。玉米叶舌是叶片与叶鞘交界处内侧的膜状突起，叶耳是叶舌两旁的一对从叶片基部边缘伸长出来的略如耳状的突出物。作为叶片和叶鞘的结合部，叶耳和叶舌使叶片与茎秆之间形成一定的角度。叶耳叶舌缺失突变体(ligulelessmutants)缺失了叶耳和叶舌(BecraftandFreeling,1991；FowlerandFreeling,1996；Moonetal.,2013)，该突变体的杂交种在田间试验中表现出了增产潜力(LambertandJohnson,1978)。我国紧凑型玉米育种的兴起受国际高光效育种和理想株型育种的影响，株型的改良可以为显著提高光合效率，株型育种和产量育种的结合，实际上就是高光效育种和理想型育种的结合。紧凑型玉米植株叶片斜举上冲，穗位以上叶夹角小于15°，一般透光性好，群体叶面积指数高，生物学产量高，适宜密植，是我国玉米高产、超高产的发展途径。玉米lg1突变体植株叶片直立，株型紧凑，且属于单基因隐性突变，即有表型即为纯合体，未发现其他不良性状，因此是发展紧凑型玉米的优良材料。CRISPR/Cas9是基于细菌或古细菌规律成簇的间隔短回文重复CRISPR(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)介导的获得性免疫系统衍生而来的基因编辑技术。该技术通过RNA碱基互补配对识别DNA，指导Cas9核酸酶切割识别的双链DNA，诱发同源重组(HDR，homologousdirectedrepair)或非同源末端链接(NHEJ，non-homologousend-joining)，进而实现目的DNA编辑。基于细菌II型免疫机制开发的基因编辑技术在植物特别是作物遗传改良上具有重大的应用前景。该技术的基本要求之一就是受体细胞内表达单分子识别RNA(sgRNA,singleguidingRNA)，该分子负责识别特异性的基因编辑位点。然后介导结合Cas9蛋白行使DNA酶切活性，在设计的位点引入DNA双链断裂损伤，通过胞内的NHEJ或HDR修复途径引入突变。因此，sgRNA的表达是该技术的重要组成部分。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何培育紧凑株型玉米。为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了培育紧凑株型玉米(叶夹角变小玉米)的方法。本专利技术所提供的培育紧凑株型玉米(叶夹角变小玉米)的方法，包括向目的玉米中导入玉米基因组编辑的载体，得到紧凑株型玉米，所述紧凑株型玉米与所述目的玉米相比，叶夹角变小；所述玉米基因组编辑的载体含有Cas9蛋白基因、sgRNA编码基因和RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子；所述RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子启动所述sgRNA编码基因的转录；所述sgRNA在玉米中识别的靶标DNA为编码LG1蛋白的DNA片段，所述LG1蛋白为a1或a2的蛋白质：a1、氨基酸序列是SEQIDNo.1的蛋白质；a2、在SEQIDNo.1所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的由a1衍生的蛋白质。上述方法中，所述LG1蛋白是SEQIDNo.1所示的氨基酸序列，含有399个氨基酸。上述方法中，所述LG1蛋白的cDNA基因，的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，SEQIDNo.2的第248-1447位为所述LG1蛋白的编码序列。上述方法中，所述sgRNA识别的靶位点序列为SEQIDNo.3所示的DNA分子。上述方法中，所述sgRNA编码基因是SEQIDNo.4的第10087-10106位所示的DNA分子。上述方法中，所述RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子可为启动子ZmPolⅢca99，所述启动子ZmPolⅢca99是下述a)或b)或c)的DNA片段：a)SEQIDNo.5所示的DNA分子；b)与a)限定的DNA序列具有75％或75％以上同一性，且具有启动子功能的DNA分子；c)在严格条件下与a)或b)限定的DNA序列杂交，且具有启动子功能的DNA分子。上述方法中，所述叶夹角变小为穗位以上叶夹角变小。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了玉米基因组编辑的载体。本专利技术所提供的玉米基因组编辑的载体，含有Cas9蛋白基因、sgRNA编码基因和RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子；所述RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子启动所述sgRNA编码基因的转录；所述sgRNA在玉米中识别的靶标DNA为编码LG1蛋白的DNA片段，所述LG1蛋白的为a1或a2的蛋白质：a1、氨基酸序列是SEQIDNo.1的蛋白质；a2、在SEQIDNo.1所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的由a1衍生的蛋白质。上述载体还包括启动Cas9蛋白基因转录的启动子(如CaMV35s增强型启动子)，终止Cas9蛋白基因转录的终止子(如NOS终止子)，复制子和抗性基因(如卡那霉素抗性基因)。上述载体中，所述sgRNA识别的靶位点序列为SEQIDNo.3所示的DNA分子。上述载体中，所述sgRNA编码基因是SEQIDNo.4的第10087-10106位所示的DNA分子。上述载体中，所述RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子可为启动子ZmPolⅢca99，所述启动子ZmPolⅢca99是下述a)或b)或c)的DNA片段：a)SEQIDNo.5所示的DNA分子；b)与a)限定的DNA序列具有75％或75％以上同一性，且具有启动子功能的DNA分子；c)在严格条件下与a)或b)限定的DNA序列杂交，且具有启动子功能的DNA分子。上述载体具体可为重组载体ZmPolⅢca99-sgRNA-Cas9，其核苷酸序列为SEQIDNo.4所示。其中，SEQIDNo.4的第12309-16409位所示的核苷酸序列为Cas9蛋白基因，SEQIDNo.4的第208-884位所示的核苷酸序列为CaMV35s增强型启动子，SEQIDNo.4的第10087-10106位所示的核苷酸序列为sgRNA的编码基因，SEQIDNo.4的第9691-10086位所示的核苷酸序列为启动子ZmPolⅢca99，SEQIDNo.4的第16477-16729位所示的核苷酸序列为NOS终止子，SEQI本文档来自技高网...

【技术保护点】
培育紧凑株型玉米的方法，包括向目的玉米中导入玉米基因组编辑的载体，得到紧凑株型玉米，所述紧凑株型玉米与所述目的玉米相比，叶夹角变小；所述玉米基因组编辑的载体含有Cas9蛋白基因、sgRNA编码基因和RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子；所述RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子启动所述sgRNA编码基因的转录；所述sgRNA在玉米中识别的靶标DNA为编码LG1蛋白的DNA片段，所述LG1蛋白为a1或a2的蛋白质：a1、氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；a2、在SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的由a1衍生的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.培育紧凑株型玉米的方法，包括向目的玉米中导入玉米基因组编辑的载体，得到紧凑株型玉米，所述紧凑株型玉米与所述目的玉米相比，叶夹角变小；所述玉米基因组编辑的载体含有Cas9蛋白基因、sgRNA编码基因和RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子；所述RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子启动所述sgRNA编码基因的转录；所述sgRNA在玉米中识别的靶标DNA为编码LG1蛋白的DNA片段，所述LG1蛋白为a1或a2的蛋白质：a1、氨基酸序列是SEQIDNo.1的蛋白质；a2、在SEQIDNo.1所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的由a1衍生的蛋白质。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述sgRNA识别的靶位点为SEQIDNo.3所示的DNA分子。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述sgRNA编码基因是SEQIDNo.4的第10087-10106位所示的DNA分子。4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述RNA聚合酶Ⅲ识别的启动子为启动子ZmPolⅢca99，所述启动子ZmPolⅢca99是下述a)或b)或c)的DNA片段：a)SEQIDNo.5所示的DNA分子；b)与a)限定的DNA序列具有75％或75％以上同一性，且具有启动子功能的DNA分子；c)在严格条件下与a)或b)限定的DNA序列杂交，且具有启动子功能的DNA分子。5.根据权利要求1-...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢传晓，李楚曦，李新海，刘昌林，刘方，王慧，
申请(专利权)人：中国农业科学院作物科学研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11