一种重组马Interferon‑alpha‑1的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种重组马Interferon‑alpha‑1的制备方法，将经过密码子优化的编码马Interferon‑alpha‑1的核苷酸序列构建入酵母细胞诱导表达载体中，然后转入酵母细胞进行培养后诱导表达，并进行纯化，从而获得重组马Interferon‑alpha‑1，较佳地，酵母细胞诱导表达载体是分泌表达载体，在诱导表达后，培养得到细胞发酵上清液，上清液采用液相柱层析方法进行纯化，本发明专利技术设计巧妙，从而可以高表达、高纯度地获得具有生物学活性的重组马Interferon‑alpha‑1，进而可以在预防马匹病毒感染时应用，以增强动物抵抗病毒的免疫反应。

【技术实现步骤摘要】
一种重组马Interferon-alpha-1的制备方法
本专利技术涉及基因工程
，特别涉及Interferon-alpha-1（干扰素α1）真核细胞表达和制备
，具体是指一种重组马Interferon-alpha-1的在酵母细胞内的重组、分泌表达和制备方法；此外本专利技术还涉及一种经密码子优化的编码马Interferon-alpha-1的核苷酸序列。
技术介绍
在被动免疫治疗和预防中，马抗体发挥了无可替代的作用。马抗蛇毒抗体是治疗蛇伤的最快速、最有效的药物。上海赛伦生物技术股份有限公司利用马匹来生产抗生物毒素抗体，如抗蝮蛇血清、抗眼镜蛇血清、抗银环蛇血清、抗五步蛇血清等。这些血清特异性地治疗相应毒蛇咬伤的病人。在我国，应用了这些抗血清后，每年挽救了上万名蛇伤病人的生命。但是免疫马匹，获得高效价抗相应蛇毒抗体的成功率相对较低，能产生高抗体效价的马匹是非常宝贵的，因此需要保证这些马匹的健康。我国每年有十几万人被毒蛇咬伤，临床使用抗蛇毒血清的量每年在10万支左右，用于免疫生产抗蛇毒血清的马匹保有量常年保持在500匹左右。这些群养的动物如果发生病毒感染，极易相互感染，需要能预防病毒感染的药物。Interferon-alpha-1（干扰素α1）具有广谱抗病毒、抑制肿瘤细胞增殖以及调节免疫功能等作用。干扰素与细胞表面受体结合，诱导细胞产生多种抗病毒蛋白，抑制病毒在细胞内增殖。同时，它还可以激活自然杀伤细胞和抗原特异性T细胞，诱导及加强细胞表面主要组织相容性复合物(MHC)抗原的表达，促进宿主免疫应答，抑制或清除细胞内病毒，可以用于马病毒性传染病的预防。鉴于制备马Interferon-alpha-1需要大量的马白细胞，马白细胞的来源极其有限，无法获得大量的天然马Interferon-alpha-1，因此，亟需研发一种重组马Interferon-alpha-1的制备方法，其可以高表达、高纯度地获得具有生物学活性的重组马Interferon-alpha-1，对抗血清制品生产的原料保证具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题之一是提供一种重组马Interferon-alpha-1的制备方法，该重组马Interferon-alpha-1的制备方法设计巧妙，从而可以高表达、高纯度地获得具有生物学活性的重组马Interferon-alpha-1，进而可以作为在病毒性疾病流行时，用于马匹，以增强动物的免疫反应。本专利技术要解决的技术问题之二是提供一种经密码子优化的编码马Interferon-alpha-1的核苷酸序列。为了解决上述技术问题，在本专利技术的第一方面，提供了一种重组马Interferon-alpha-1的制备方法，该方法包括如下步骤：（1）将经过密码子优化的编码马Interferon-alpha-1的核苷酸序列构建入酵母细胞诱导表达载体中；（2）然后转入酵母细胞进行培养后诱导表达；（3）进行纯化，从而获得所述重组马Interferon-alpha-1。其中，培养转化的酵母细胞所用的材料不含任何动物或人来源的物质，而且能在发酵过程中获得高细胞密度。培养转化的酵母细胞进行在含一种或多种可供选择的材料，如酵母提取物，甘油、甲醇和含氮盐类的培养基中实施。较佳地，所述核苷酸序列是如SEQIDNO:1所示的序列。编码如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。所述酵母细胞可以是任何合适的酵母细胞。较佳地，所述酵母细胞是毕赤酵母细胞（即Pichiapastoris细胞）。更佳地，所述毕赤酵母细胞（即Pichiapastoris细胞）是GS115细胞。所述酵母细胞表达载体是毕赤酵母表达载体，载体转染入毕赤酵母细胞（Pichiapastoris细胞）后与酵母染色体重组整合入酵母染色体中。所述的酵母表达载体是适合于毕赤酵母细胞（Pichiapastoris细胞）的表达载体。较佳地，所述的酵母表达载体为Pichiapastoris分泌型载体。更佳地，所述的酵母表达载体为Pichiapastoris分泌型载体，其所用的启动子为AOX1启动子。能表达Interferon-alpha-1。较佳地，所述诱导表达在培养液的OD600达到20-400时启动。更佳地，所述OD600为50-300。更进一步地，所述OD600为150-250。较佳地，所述的表达载体是分泌型表达载体，更进一步地，所述诱导表达通过甲醇进行。较佳地，所述纯化采用离子交换层析将所述重组马Interferon-alpha-1以单体形式分离。重组Interferon-alpha-1纯化后可以进一步超滤浓缩然后添加保护剂和/或冷冻干燥保存。在本专利技术的第二方面，提供了一种密码子优化的编码Interferon-alpha-1的核苷酸序列，其特点是，所述核苷酸序列是如SEQIDNO:1所示的序列，适于上述的重组马Interferon-alpha-1的制备方法。本专利技术的有益效果在于：本专利技术的重组马Interferon-alpha-1的制备方法是将经过密码子优化的编码马Interferon-alpha-1的核苷酸序列构建入酵母细胞诱导表达载体中，然后转入酵母细胞进行培养后诱导表达，并进行纯化，从而获得所述重组马Interferon-alpha-1，表达量可达约500mg/l；纯度高，经检测，不含可以用SDS-PAGE或HPLC检测到的酵母细胞蛋白或其它残留物，通过实验表明获得的重组马Interferon-alpha-1具有生物学活性，因此本专利技术的重组马Interferon-alpha-1的制备方法设计巧妙，从而可以高表达、高纯度地获得具有生物学活性的重组马Interferon-alpha-1，进而可以作为大规模马匹饲养时在病毒性疾病流行时预防性使用，以增强动物的免疫反应，提高动物抵抗病毒传染病的能力，适于大规模推广应用。附图说明图1是本专利技术实施例2中马Interferon-alpha-1在毕赤酵母中表达所用的载体结构图谱。采用AOX1启动子与酵母ɑ-factorsecretionsignal分泌表达目的蛋白。图2是本专利技术实施例2中表达马Interferon-alpha-1的重组Pichiapastoris诱导后的上清液在还原条件下SDS-PAGE结果示意图。图2中从左到右，1：为蛋白分子量标准；2.为GS115酵母细胞；3-15为挑取的13个在无精氨酸培养板上生长的克隆。图3是本专利技术实施例3中离子交换层析图谱，第一峰是上样流穿峰，第二峰为氯化钠洗脱蛋白，此峰洗脱的蛋白为马Interferon-alpha-1；第三峰为氢氧化钠清洗杂蛋白峰。图4是本专利技术实施例3中离子交换层析样品SDS-PAGE的结果示意图，从左到右，1：培养上清液；2:离子交换层析流穿液；3：氯化钠洗脱蛋白；4：蛋白分子量标准。具体实施方式为了能够更清楚地理解本专利技术的
技术实现思路
，特列举以下具体实施例详细说明。然而，具体实施例仅仅是用于举例说明，而不是对本专利技术的限制。实施例I：表达序列获取和优化为了达到使马Interferon-alpha-1在酵母细胞内高表达这个目的，通过查文献得到该完整基因的氨基酸序列（即SEQIDNO:4所示的氨基酸序列）。根据这个氨基酸序列，确定编码马Interferon-alpha-1的核苷酸序本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组马Interferon‑alpha‑1的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：（1）将经过密码子优化的编码马Interferon‑alpha‑1的核苷酸序列构建入酵母细胞诱导表达载体中；（2）转入酵母细胞进行培养后诱导表达；（3）进行纯化，从而获得所述重组马Interferon‑alpha‑1。

【技术特征摘要】
1.一种重组马Interferon-alpha-1的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：（1）将经过密码子优化的编码马Interferon-alpha-1的核苷酸序列构建入酵母细胞诱导表达载体中；（2）转入酵母细胞进行培养后诱导表达；（3）进行纯化，从而获得所述重组马Interferon-alpha-1。2.根据权利要求1所述的重组马Interferon-alpha-1的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述核苷酸序列是如SEQIDNO:2所示的序列。3.根据权利要求1所述的重组马Interferon-alpha-1的制备方法，所述酵母细胞是毕赤酵母细胞。4.根据权利要求4所述的重组马Interferon-alpha-1的制备方法，其特征在于，所述毕赤酵母细胞是GS115细胞。5.根据权利要求1所述的重组马Interferon-alpha-1的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述酵母细胞诱导表达载体是分泌表达载体，其所用的启动子为AOX1启动子，在步骤（2）所述诱导表达后，细胞培养上清中含有所述重组马Interferon-alpha-1。6.根据权利要求5所述的重组马Interferon-alpha-1的制备方法，其特征在于，所述分泌表达载体是毕赤酵母表达载体，具体为pPIC9表达载体，载体转染入毕赤酵母细胞后与酵母染色体重组整合入酵母染色体中。7.根据权利要求6所述的重组马Interferon-alpha-1的制备方法，其特征在于，步骤（1）具体为，含密码子优化的马Interferon-alpha-1的核苷酸序列在5’端加上XhoI位点和AAAAGA核苷酸序列，在3’端加入EcoRI位点；选用pPIC9质粒，用XhoI和EcoRI双酶切使之线性化；将具有XhoI和EcoRI酶切获得的马Interferon-alpha-1DNA与XhoI和EcoRI线性化的pPIC9质粒连接，然后转化大肠杆菌菌株DH5ɑ获得pPIC9-Interferon-alpha-1表达载体。8.根据权利要求1所述的重组马Interferon-alpha-1的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述诱导表达通过甲醇诱导；所述诱导表达在培养液的OD600达到20-...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙九如，史小月，柏伟，范志和，
申请(专利权)人：上海赛伦生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31