用酵母制备三聚体埃博拉病毒糖蛋白突变体的方法技术

本发明专利技术公开了一种用酵母制备三聚体埃博拉病毒糖蛋白突变体的方法。该方法包括如下步骤：1)将编码埃博拉病毒糖蛋白突变体(缺失了黏蛋白样区域和C‑端穿膜区的博拉病毒糖蛋白)的基因导入受体酵母细胞中，得到重组酵母细胞；2)对重组酵母细胞依次进行培养、破碎，从破碎产物中获得博拉病毒糖蛋白突变体。用本发明专利技术制备的埃博拉病毒糖蛋白突变体所制备的埃博拉出血热预防用疫苗，可诱导小鼠产生显著的针对埃博拉病毒糖蛋白的抗体滴度。本发明专利技术具有工程菌株构建、培养周期短、培养条件简单、成本低、适于大规模发酵、安全、无毒素产生以及可进行蛋白质翻译后修饰加工扥典型特点，适合在突发疫情等应急条件下，进行疫苗高效研发和大规模生产。

【技术实现步骤摘要】
用酵母制备三聚体埃博拉病毒糖蛋白突变体的方法
本专利技术属于生物
，涉及一种用酵母菌制备具有三聚体结构的埃博拉病毒糖蛋白突变体的方法。
技术介绍
埃博拉病毒包膜糖蛋白(GP)是埃博拉病毒表面的唯一表面蛋白，以三聚体为一个结构单元的形式存在，埃博拉病毒的包膜糖蛋白GP是病毒粒子唯一的表面蛋白，在病毒入侵的过程中发挥着重要的作用，同时也是中和抗体主要的作用靶标，因此是埃博拉出血热预防疫苗的主要成分。疫苗接种作为一种最简单有效的防治手段，在病毒疫情的预防中有着重要的作用，在埃博拉病毒疫苗的开发上，现有的研究内容大致分为如下几大类：第一类包括灭活疫苗、反向遗传修饰的疫苗和DNA疫苗，这一类的疫苗在目前对于此类疫苗的免疫原性、安全性和有效性进行研究中，已经被证明不适合作为埃博拉疫苗的疫苗类型；第二类我们称为载体类疫苗，此类疫苗是利用腺病毒(Adenovirus)载体、水疱性口炎病毒(Vesicularstomatitisvirus,VSV)载体、牛痘病毒载体、人3型副流感病毒载体、新城疫病毒载体、狂犬病毒载体等插入埃博拉病毒部分抗原基因开发得到的疫苗形式，这类疫苗已经被证明拥有很好的保护力而且其安全性也很好，但是作为载体类疫苗其缺点在于预存免疫和疫苗的保存运输要求较高；第三类为蛋白类疫苗，蛋白类疫苗顾名思义就是以病毒蛋白组分作为主要组成部分的一类疫苗，现在研究的主要有病毒样颗粒疫苗(VLPs)和亚单位疫苗。有研究显示，在哺乳动物细胞或者杆状病毒表达系统中共表达GP蛋白和VP40蛋白，或者GP蛋白、VP40蛋白和NP蛋白时可以自组装形成病毒样的颗粒，利用VLPs免疫后攻毒可以使食蟹猴获得100％的保护，而且疫苗诱导动物产生了明显的体液和细胞免疫反应。而以GP融合人IgG1Fc段重组蛋白作为保护性抗原制备的亚单位疫苗也在被证实可以给与小鼠和豚鼠百分百的保护力。在天然状态下GP蛋白以一个三聚体为一个结构单元镶嵌在病毒膜上，三聚体的保持对于EBOV-GP蛋白功能和免疫原性的保持有着重要的作用。GP蛋白是一个高度糖基化修饰的蛋白，在GP1上存在着聚糖帽(GlycanCap)和黏蛋白样区(mucinlikedomain，MLD)两个高度糖基化修饰的区域。在病毒入侵的过程中会由组织蛋白酶B/L的切割切除GlycanCap和mucinlikedomain两个高度糖基化修饰的糖帽使其RBS与宿主细胞上的NCP1受体结合，激发GP2上的融合loop发生变构，介导病毒的入侵。研究表明EBOV-GP蛋白的糖基化修饰区域，还与病毒吸附、蛋白质折叠、空间构象的维持是紧密相关的，而且往往参与抗原表位的构成，以N563位的N-糖基化修饰为例，突变N563位的N-糖基化修饰位点后，可以完全解除与中和抗体KZ52的结合。埃博拉包膜蛋白GP的糖基化修饰同一般的糖基化修饰蛋白一样，其糖基化修饰主要有N-连接的糖基化修饰和O-连接的糖基化修饰两种类型，而且GP蛋白的这些糖基化修饰几乎全部集中于GlycanCap和mucinlikedomain这两个高度糖基化修饰的区域，GlycanCap的糖基化修饰全为N-连接的糖基化修饰，而mucinlikedomain除了含有几个N-糖基化位点以外还含有大量的O-连接糖基化修饰位点，完全糖基化修饰之后的mucinlikedomain区域其分子量和空间体积大小都与缺失mucinlikedomain区域的GP蛋白相当。OsvaldoMartinez等通过研究发现切除mucinlikedomain的GP蛋白与全长的GP蛋白相比，诱导小鼠产生的抗体滴度差异较为显著，但是其血清中中和抗体的效价却是相当的，说明小鼠产生的针对mucinlikedomain区域多为非中和抗体(OsvaldoM,LeeT,NirupamaM,etal.ImpactofEbolaMucin-LikeDomainonAntiglycoproteinAntibodyResponsesInducedbyEbolaVirus-LikeParticles[J].TheJournalofInfectiousDiseases,2011,204:S825–S832)。糖蛋白的典型特征就是其在表达的过程中会产生糖基化修饰，而蛋白质的糖基化修饰特别是较为复杂的糖基化修饰都是在真核细胞中进行的，所以在选择表达系统时应该选用真核表达系统来表达。现有的针对埃博拉出血热预防用疫苗的基于埃博拉病毒GP蛋白的蛋白类疫苗的研究全是在细胞表达系统或原核表达系统里进行的。而毕赤酵母作为最简单常用的真核表达系统之一，有着培养周期短、培养条件简单、成本低、适宜于大规模发酵、安全、无毒素产生以及可以进行蛋白质翻译后修饰加工这些典型的优势，但其分泌效率特别是对于分子量较大的蛋白的分泌效率要低于细胞平台，而且酵母菌有着十分厚实坚固的细胞壁，在对胞内蛋白的纯化时难度要比细胞平台大。目前未见有用酵母制备具有糖基化修饰与三聚体结构的埃博拉病毒糖蛋白的报导。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种制备具有成熟肽结构和三聚体结构且拥有糖基化修饰的埃博拉病毒三聚体糖蛋白突变体的方法。本专利技术中所述的埃博拉病毒糖蛋白均为埃博拉病毒的包膜糖蛋白(GP)。本专利技术所提供制备埃博拉病毒糖蛋白突变体的方法，可包括如下步骤：(1)将编码埃博拉病毒糖蛋白突变体的基因导入受体酵母细胞中，得到表达所述基因的重组酵母细胞；(2)对所述重组酵母细胞依次进行培养、破碎，从破碎产物中获得所述博拉病毒糖蛋白突变体；所述博拉病毒糖蛋白突变体为缺失了黏蛋白样区域(mucinlikedomain，MLD)和C-端穿膜区(TM)的博拉病毒糖蛋白。获得编码所述博拉病毒糖蛋白突变体的基因的方法具体可为全基因合成法、PCR融合法或分片段缺失后片段融合法。其中，所述酵母可为毕赤酵母、酿酒酵母、汉逊酵母或乳酸克鲁维酵母。在本专利技术的一个实施例中，所述酵母具体为毕赤酵母GS115。其中，所述博拉病毒可为苏丹型埃博拉病毒(SudanEbolavirus)、扎伊尔型埃博拉病毒(ZaireEbolavirus)、科特迪瓦型埃博拉病毒(Coted’IvoireEbolavirus)、本迪布焦埃博拉病毒(BundibugyoEbolavirus)或雷斯顿型埃博拉病毒(RestonEbolavirus)。当然，将本专利技术的方法用于与埃博拉病毒关系密切的马尔堡病毒(Marburgvirus)也属于本专利技术的保护范围。在步骤(2)中，进行所述培养的过程中，还包括向培养体系中加入体积百分比为0.5％的甲醇的步骤，目的是为了诱导所述博拉病毒糖蛋白突变体的表达。每12小时加入一次甲醇，持续到72小时止。在步骤(2)中，进行所述破碎的方法可为物理方法、生物方法或化学方法。其中，所述物理方法具体可为高压匀浆法、玻璃珠震荡法或球磨法；所述生物方法具体可为酶消化裂解法；所述化学方法具体可为碱裂解法。在步骤(2)中，进行所述破碎后还包括加入去污剂，获得含有所述埃博拉病毒糖蛋白突变体的粗提液的步骤。其中，所述去污剂可为离液剂、非离子型去污剂、弱离子型去污剂或两性离子去污剂。所述离液剂具体可为尿素或硫脲；所述非离子型去污剂具体可为曲拉通、吐温或乙基苯基聚乙二醇；所述弱离子型去污剂具体可为脱氧本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备埃博拉病毒糖蛋白突变体的方法，包括如下步骤：(1)将编码埃博拉病毒糖蛋白突变体的基因导入受体酵母细胞中，得到表达所述基因的重组酵母细胞；(2)对所述重组酵母细胞依次进行培养、破碎，从破碎产物中获得所述博拉病毒糖蛋白突变体；所述博拉病毒糖蛋白突变体为缺失了黏蛋白样区域和C‑端穿膜区的博拉病毒糖蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种制备埃博拉病毒糖蛋白突变体的方法，包括如下步骤：(1)将编码埃博拉病毒糖蛋白突变体的基因导入受体酵母细胞中，得到表达所述基因的重组酵母细胞；(2)对所述重组酵母细胞依次进行培养、破碎，从破碎产物中获得所述博拉病毒糖蛋白突变体；所述博拉病毒糖蛋白突变体为缺失了黏蛋白样区域和C-端穿膜区的博拉病毒糖蛋白。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述酵母为毕赤酵母、酿酒酵母、汉逊酵母或乳酸克鲁维酵母；和/或所述博拉病毒为苏丹型埃博拉病毒、扎伊尔型埃博拉病毒、科特迪瓦型埃博拉病毒、本迪布焦埃博拉病毒或雷斯顿型埃博拉病毒。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，进行所述培养的过程中，包括向培养体系中加入体积百分比为0.5％的甲醇的步骤；和/或步骤(2)中，进行所述破碎的方法为物理方法、生物方法或化学方法；所述物理方法具体为高压匀浆法、玻璃珠震荡法或球磨法；所述生物方法具体为酶消化裂解法；所述化学方法具体为碱裂解法；和/或步骤(2)中，进行所述破碎后还包括加入去污剂，获得含有所述埃博拉病毒糖蛋白突变体的粗提液的步骤；所述去污剂为离液剂、非离子型去污剂、弱离子型去污剂或两性离子去污剂；所述离液剂具体为尿素或硫脲；所述非离子型去污剂具体为曲拉通、吐温或乙基苯基聚乙二醇；所述弱离子型去污剂具体为脱氧胆酸盐；所述两性离子去污剂具体为3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐或3-1-烷磺酸；和/或步骤(2)中，还包括对所述粗提液进行纯化的步骤；所述纯化为对所述粗提液依次进行亲和层析、凝胶排阻层析和离子交换层析；所述亲和层析介质具体为ChelatingFastFlow或Ni-NTA；所述凝胶排阻层析介质具体为SephadexG25、Superdex200或Superose6凝胶预装柱；所述离子交换层析具体为阳离子交换层析或阴离子交换层析；所述阳离子交换层析介质具体为SOURCE30S、SepharoseFastFlowSP或CMFastFlow；所述阴离子交换层析介质具体为SOURCE30QFastFlow。4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，编码所述埃博拉病毒糖蛋白突变体的基因为如下(b1)-(b6)中任一所示DNA分子：(b1)序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴军，吴慕胜，刘波，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11