本发明专利技术属于分子生物学与生物医学技术领域。具体的说，本发明专利技术涉及基于CRISPR/Cas9系统的gRNA序列在敲除人Lin28A基因的应用以及肿瘤治疗中的应用。本发明专利技术根据CRISPR/Cas9的设计原则，设计了6个向导RNA（gRNA），其序列表见SEQ ID NO.1‑6所示，并且将其构建在PX458载体上，经活性检测筛选获得2个高效靶向gRNA。在人肝癌细胞株(HepG2)和人黑色素瘤细胞株（A375）中利用这2个gRNA指导的CRISPR/Cas9系统，可以有效的敲除人Lin28A基因，这一系统易于操作，人Lin28A基因敲除效率高，适用于多种肿瘤细胞模型。本发明专利技术涉及的gRNA有望在治疗肿瘤的新型药物中得到应用。
【技术实现步骤摘要】
CRISPR/Cas9靶向敲除人Lin28A基因及其特异性gRNA
本专利技术属于分子生物学与生物医学
，具体涉及CRISPR/Cas9特异性敲除人基因组Lin28A基因的方法以及用于靶向人Lin28A基因的gRNA。
技术介绍
基因敲除，即针对某个特定的基因，通过破坏或改变其基因序列令其功能丧失的一种技术手段。常用的基因敲除方法包括：锌指核酸酶（ZFNs）(Milleretal.,2007;PorteusandBaltimore,2003;Woodetal.,2011)、类转录因子活化因子核酸酶（TALEN）(Milleretal.,2011;Woodetal.,2011;Zhangetal.,2011)，以及最近发现的原核生物第二类适应性免疫系统CRISPER/Cas9系统(Congetal.,2013;Malietal.,2013)等。CRISPER/Cas9系统原本被细菌免疫系统用来抵御外源病毒或质粒。在第二类CRISPER系统中，Cas9核酸内切酶在sgRNA的引导下切割双链DNA，造成基因组双链断裂，利用细胞基因组修复的不稳定性产生修复错误（碱基的缺失或插入），从而可能造成基因功能的丧失，实现基因敲除的目的。Lin28A是一种高度保守的RBP，是miRNA调节蛋白。有研究显示Lin28属于一种致癌基因，在多种肿瘤组织或细胞系中高表达，促进肿瘤细胞的增殖和肿瘤的进展，而且多出现在低分化以及愈后差的肿瘤中。尽管Lin28A促进肿瘤发生的确切机制还不明确，但已经有大量的证据表明Lin28/let-7双向负反馈通路可以与一些因子（如RAS，MYC，NF-κB）结合，形成一个复杂的网络参与致癌作用。Lin28A还是肿瘤细胞中多种与生长相关的上游基因（例如HER2和HMGA1）的主调节器，这一发现可能为更有效地诊断和治疗肿瘤开辟新的方向。Lin28A作为一种参与诱导多能干细胞的多能因子可能成为肿瘤的潜在治疗靶点。因此，本专利技术开发出一种高效、靶向敲除人Lin28A基因的gRNA，对于CRISPR/Cas9系统充分发挥作用和肿瘤治疗的靶标的研究具有极其重要的作用。
技术实现思路
本专利技术目的在于通过设计、构建、筛选，最终提供一些基于CRISPR/Cas9系统，同时靶向人Lin28A基因的高效gRNA及其靶位点序列，并用其抑制人Lin28A基因的表达，从而抑制肿瘤细胞的增值。为实现上述目的，本专利技术以CRISPR/Cas9系统原理及其gRNA的设计原理为基础，设计出6个gRNA，并以PX458为表达载体，构建了gRNA/Cas9表达系统。通过筛选和系列分析测试，最终筛选出2个高效的gRNA，并在HepG2和A375肿瘤细胞中制备出Lin28A基因缺陷型肿瘤细胞模型。本专利技术技术方案如下：靶向人Lin28A基因的高效gRNA、靶点序列的设计及gRNA/Cas9表达系统构建；在肿瘤细胞模型中分析检测gRNA对于肿瘤细胞Lin28A基因靶点的靶向性，筛选到2个高效的gRNA，其对应的DNA序列如序列表SEQIDNO.1和SEQIDNO.5任意一条序列所示，然后再制备出HepG2和A375肿瘤细胞Lin28A基因缺陷型肿瘤细胞模型。附图说明附图1为T7EndonucleaseI酶切结果图；附图2为A375测序结果图；附图3为HepG2测序结果图；附图4为Westernblot检测缺陷株和正常株Lin28A蛋白表达结果图。具体实施方式实施例1靶向人Lin28A基因的gRNA合成及载体构建1、靶向人Lin28A基因的gRNA的选择和设计在Genebank中找到人Lin28A基因的序列，在人Lin28A基因的外显子区域设计潜在靶位点；通过在线设计工具（http://crispr.mit.edu/）及gRNA的设计原则，评估人Lin28A基因序列上得分较高的靶位点设计gRNA。2、靶向人Lin28A基因的gRNA寡核苷酸序列的合成和真核表达载体的构建将pSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458)质粒（AddgeneplasmidID：48138，以下简称PX458），用BbSI酶切，37℃水浴1h后，1%的琼脂糖电泳，回收酶切产物（TAKARA胶回收试剂盒）。酶切体系如下：将两寡核苷酸退火，形成带有粘性末端的短双链DNA。反应体系如下：将上述反应体系在200μLPCR管中混合均匀，然后将PCR管在37℃水浴锅中处理30min，再放入500ml沸水中，自然冷却至室温。连接体系：将带有粘性末端的双链短DNA产物连入酶切后的PX458线性片段，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞（TakaraCode:D9057A），并涂布于氨苄青霉素浓度为100μg/mL的LB固体平板上培养过夜，挑取生长良好的单菌落，于15mL氨苄青霉素浓度为100μg/mL的LB液体培养基中，置于250rpm、37℃振荡培养过夜，提取质粒，命名为PX458-Lin28A-T1。同样的方法，对应靶点编号构建出CRISPR/Cas9载体，分别命名为PX458-Lin28A-T2、PX458-Lin28A-T3、PX458-Lin28A-T4、PX458-Lin28A-T5和PX458-Lin28A-T6。3、无内毒素质粒DNA的制备A、分别取PX458-Lin28A-T1、PX458-Lin28A-T2、PX458-Lin28A-T3、PX458-Lin28A-T4、PX458-Lin28A-T5和PX458-Lin28A-T6质粒各1μL加入100μLDH5α感受态细胞中吹匀，冰中静置20min，再放入42℃水浴90s，迅速置于冰浴中3min，加入500μLLB液体培养基，放置摇床180rpm37℃1h，取菌液100μL均匀涂布于氨苄青霉素浓度为100μg/mL的LB固体培养基37℃培养过夜；B、取单菌落3mL于氨苄青霉素浓度为100μg/mL的LB液体培养基中，250rpm、37℃振荡培养8h；从中取300μL菌液接种于300mL氨苄青霉素浓度为100μg/mL的LB液体培养基中，并于250rpm、37℃振荡培养12~16h；C、收集菌液，然后在4℃、4000rpm条件下离心15min，弃上清，收集菌体，然后按照QIAGENEndoFreePlasmidMaxiKit试剂盒说明书操作步骤提取质粒，得无内毒素的PX458-Lin28A-T1、PX458-Lin28A-T2、PX458-Lin28A-T3、PX458-Lin28A-T4、PX458-Lin28A-T5和PX458-Lin28A-T6载体。实施例2制备人黑色素瘤细胞和人肝癌细胞敲除Lin28A基因细胞株复苏人黑色素瘤细胞（A375细胞株，中科院上海细胞库），将细胞放入加有10%的FBS+DMEM培养瓶中，于37℃、5%CO2的培养箱中培养，转染前1天，传代培养细胞。将培养A375细胞T75瓶中的培养基吸净，加入2mL4℃冰箱取出的0.25%胰酶，使其均匀覆盖瓶底，置于37℃培养箱中3~5min，取出，摇晃可发现细胞于底部脱离，将其全部晃下，加入3mL37℃水浴中预热的10％DMEM，用10mL移液管进行吹打，吹打6~8次，不留死角，瓶口处较难吹打可将移液管对准瓶口，小力将培养基打本文档来自技高网...
【技术保护点】
在CRISPR/Cas9特异性敲除人Lin28A基因中用于靶向人Lin28A基因的 gRNA，所述 gRNA 在人Lin28A基因上的靶序列符合5’‑ N (20)‑NGG3’ 或 者5’‑CCN‑ N (20)‑3’的序列排列规则，在人Lin28A基因上的靶序列是唯一的，其特征在于：所述gRNA在人Lin28A基因的靶向位点位于人Lin28A基因的外显子上。
【技术特征摘要】
1.在CRISPR/Cas9特异性敲除人Lin28A基因中用于靶向人Lin28A基因的gRNA，所述gRNA在人Lin28A基因上的靶序列符合5’-N(20)-NGG3’或者5’-CCN-N(20)-3’的序列排列规则，在人Lin28A基因上的靶序列是唯一的，其特征在于：所述gRNA在人Lin28A基因的靶向位点位于人Lin28A基因的外显子上。2.根据权利要求1所述的在CRISPR/Cas9特异性敲除人Lin28A基因中用于靶向人Lin28A基因的gRNA，其特征在于：对应的核酸序列如序列表SEQIDNO.1和SEQIDNO.5任意一条序列所示。3.根据权利要求1-2所述的在CRISPR/Cas9特异性敲除人Lin28A基因中用于靶向人Lin28A基因的gRNA，其特征在于：该gRNA在治疗肿瘤的新型药物中的应用。4.CRISPR/Cas9特异性敲除人Lin28A基因的方法，具体包括如下步骤：（1）如权利要求1-3任意一项所述的gRNA，在其对应DNA序列的5’末端加上C...
【专利技术属性】
技术研发人员：周勇，申友锋，
申请(专利权)人：重庆高圣生物医药有限责任公司，
类型：发明
国别省市：重庆,50
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