一种用于蛋白标记及检测的荧光探针及其合成方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种用于蛋白标记及检测的荧光探针及其合成方法与应用。本探针通过4-溴-1,8-萘酐与叠氮化钠、九水硫化钠、乙酰氯、二乙胺等反应得到,其结构为：

【技术实现步骤摘要】
一种用于蛋白标记及检测的荧光探针及其合成方法与应用
本专利技术涉及一种用于蛋白标记的新型荧光探针的合成方法及应用。
技术介绍
随着分子生物学，分析化学以及有机化学的逐步发展，研究工作者对蛋白功能及结构的研究，含量的检测，实时的追踪的需求极为迫切。因而，有机小分子荧光探针作为一种重要的蛋白标记手段逐渐被广泛应用于蛋白的监测。近年来，有机小分子荧光探针对蛋白的标记主要通过共价键(双砷-四半胱氨酸体系、SNAP-tag、Halo-tag等)，非共价键(氢键，金属配位等)以及基因工程(非天然氨基酸等)等对目标蛋白进行修饰而达到荧光标记的效果。SNAP-tag蛋白是对由207个氨基酸组成的DNA修复蛋白酶(O6-鸟嘌呤-DNA烷基转移酶，hAGT)进行突变改造而获得的。其中作为反应位点的半胱氨酸能够与O6修饰的苯甲基鸟嘌呤进行亲核反应。脱去鸟嘌呤后，半胱氨酸能够与苄基形成稳定的硫醚键，从而以共价键形式达到与荧光底物高特异性的结合。因此，通过有机合成手段可以将多种多样的有机小分子荧光探针引入苄基端，从而达到荧光探针与SNAP-tag蛋白的特异性结合。有机小分子荧光探针作为蛋白的标记和检测手段的实例以屡见不鲜，但是在诸多荧光探针中其主要表现为与蛋白结合后出现荧光增强并伴有荧光的蓝移，这种探针容易受到设备、样品等外界因素影响。比率型的荧光探针能很好地克服这类缺点，但是成功用于蛋白标记与检测的却较为少见。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一类用于蛋白标记的荧光探针的生物应用，该探针能够与SNAP-tag蛋白特异性结合并呈现出长波～550nm处的荧光增强。本专利技术的另一目的是提供一类用于蛋白标记的荧光探针的合成方法，该方法具有操作方便、原料廉价、提纯简单等优点。本专利技术提供一种用于荧光标记的荧光探针，以4-(2-(N,N-二乙基氨基)乙酰基)氨基-1,8-萘酰亚胺为荧光基团，苄氧基为结合位点，荧光探针能够特异性与SNAP蛋白结合并呈现～8倍荧光增强，其在～550nm处荧光强度比例明显增加。该荧光探针具有如下结构：其中R为R1：或R2：中的一种或二种；当R为R1时，探针为探针1，当R为R2时，探针为探针2，结构为：用于蛋白标记及检测的荧光探针合成路线，如下：具体合成步骤如下：(1)中间体4-叠氮基-1,8-萘酐的合成：将4-溴-1,8-萘酐溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)制成反应液。叠氮化钠溶于水中，滴加至反应液，加热至90-100℃，持续4-8h，冷却，倒入200-300mL冰水中抽滤，得4-叠氮基-1,8-萘酐。(2)中间体4-氨基-1,8-萘酐的合成：将4-叠氮基-1,8-萘酐置于乙腈中，并加入九水硫化钠。加热至50-70℃，持续8-20h，冷却，倒入200-300mL冰水中，抽滤得4-氨基-1,8-萘酐。(3)中间体4-(2-氯乙酰基)氨基-1,8-萘酐的合成：将4-氨基-1,8-萘酐置于四氢呋喃中，并在冰浴下加入氯乙酰氯。室温搅拌过夜(10-16h)，减压除去溶剂，硅胶柱分离，以二氯甲烷为洗脱剂，减压除去溶剂得4-(2-氯乙酰基)氨基-1,8-萘酐。(4)中间体4-(2-(N,N-二乙基氨基)乙酰基)氨基-1,8-萘酐的合成：将4-(2-氯乙酰基)氨基-1,8-萘酐置于乙腈中，搅拌下加入二乙胺。加热至50-70℃，2-4h，减压除去溶剂，硅胶柱分离，以二氯甲烷：甲醇＝100:1-20:1为洗脱剂，减压除去溶剂得4-(2-(N,N-二乙基氨基)乙酰基)氨基-1,8-萘酐。(5)当R为R1时，合成探针1：将4-(2-(N,N-二乙基氨基)乙酰基)氨基-1,8-萘酐溶于乙醇中，搅拌下加入正丁胺。加热至80-90℃，3-6h，减压除去溶剂，得探针1；或，当R为R2时，合成探针2：将4-(2-(N,N-二乙基氨基)乙酰基)氨基-1,8-萘酐溶于乙醇中，搅拌下加入2-氨基-6-(4-氨甲基)苄氧基-嘌呤。加热至80-90℃，3-6h，减压除去溶剂，硅胶柱分离，以二氯甲烷：甲醇＝50:1-10:1为洗脱剂，减压除去溶剂得探针2。步骤(1)中，4-溴-1,8-萘酐、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、叠氮化钠,其质量比例为2:10:1-2:30:1。步骤(2)中，4-叠氮基-1,8-萘酐、乙腈、九水硫化钠，其质量比为1:50:3-1:100:8。步骤(3)中，4-氨基-1,8-萘酐、四氢呋喃、氯乙酰氯，其质量比为5:80:1-5:160:2。所述硅胶柱分离,以二氯甲烷为洗脱剂，减压除去溶剂得4-(2-氯乙酰基)氨基-1,8-萘酐。步骤(4)中，4-(2-氯乙酰基)氨基-1,8-萘酐、乙腈、二乙胺，其质量比为2:80:1-2:160:1.5。所述硅胶柱分离，以二氯甲烷：甲醇＝100:1-20:1为洗脱剂，减压除去溶剂得4-(2-(N,N-二乙基氨基)乙酰基)氨基-1,8-萘酐。。步骤(5)中，4-(2-(N,N-二乙基氨基)乙酰基)氨基-1,8-萘酐、乙醇、正丁胺，其质量比为1:200:1-1:800:3；4-(2-(N,N-二乙基氨基)乙酰基)氨基-1,8-萘酐、乙醇、2-氨基-6-(4-氨甲基)苄氧基-嘌呤,其质量比为1:200:1.5-1:800:3；所述硅胶柱分离，以二氯甲烷：甲醇＝50:1-10:1为洗脱剂，减压除去溶剂得探针2。。上述的用于蛋白标记及检测的荧光探针在SNAP蛋白标记与检测及在生物荧光成像中可以应用。本专利技术具有以下特征：该类探针拥有合成原料低价、方法简单易操作、易纯化等优点。该类探针在水溶液中呈现出～470nm的蓝色荧光，在乙醇、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺等极性溶剂中呈现出525-560nm的绿色到黄色荧光。在水溶液与不同有机极性溶剂混合液中，随着有机极性溶剂的增加～470nm处荧光逐渐减弱而～550nm处的荧光逐渐增强。该类探针能成功用于荧光标记，探针2与SNAP-tag蛋白特异性结合之后，～550nm处荧光比例明显增加，通过这种比率的变化，可以排除其他因素的干扰，达到更精准的定位SNAP-tag蛋白。该类探针可以通过SNAP-tag技术，引入到目标蛋白中，对目标蛋白进行更精准的监测。其可应用于生物荧光成像等领域。附图说明图1该类荧光探针合成路线图。图2实施例1制备的该荧光探针1核磁谱图氢谱。图3实施例1制备的该荧光探针1核磁谱图碳谱。图4实施例1制备的该荧光探针2核磁谱图氢谱图5为实施例1制备的探针1在不同溶剂中的荧光谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度，荧光探针的浓度为10μM。图6为实施例1制备的探针1在不同溶剂中的紫外吸收谱图，横坐标为波长，纵坐标为吸收强度，荧光探针的浓度为10μM。图7为实施例1制备的探针1在水与二甲基亚砜不同比例(水：二甲基亚砜＝10:0,9:1,8:2,7:3,6:4,5:5,4:6,3:7,2:8,1:9,0:10)下荧光谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度，荧光探针的浓度为10μM。图8实施例1制备的探针2与10μMSNAP-tag蛋白结合前后荧光谱图。图9实施例1制备的探针2与10μMSNAP-tag蛋白结合前后归一化荧光谱图。具体实施方式实施例1：定位于溶酶体的H2S荧光探针的合成方法。中间体4-叠氮基-1,8-萘酐的合成：将4-溴-1,8-萘酐(2.0本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于蛋白标记及检测的荧光探针，其特征在于：包括探针1和/或探针2，结构如下：

【技术特征摘要】
1.一种用于蛋白标记及检测的荧光探针，其特征在于：包括探针1和/或探针2，结构如下：其中R为R1：或R2：中的一种或二种；当R为R1时，上述结构为探针1，当R为R2时，上述结构为探针2，探针2的结构为：2.一种如权利要求1所述的用于蛋白标记及检测的荧光探针的合成方法，其特征包含步骤如下：(1)中间体4-叠氮基-1,8-萘酐的合成：将4-溴-1,8-萘酐溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)制成反应液，叠氮化钠溶于水中，滴加至反应液，加热至90-100℃，持续4-8h，冷却，倒入200-300mL冰水中抽滤，得4-叠氮基-1,8-萘酐；(2)中间体4-氨基-1,8-萘酐的合成：将4-叠氮基-1,8-萘酐置于乙腈中，并加入九水硫化钠，加热至50-70℃，持续8-20h，冷却，倒入200-300mL冰水中，抽滤得4-氨基-1,8-萘酐；(3)中间体4-(2-氯乙酰基)氨基-1,8-萘酐的合成：将g4-氨基-1,8-萘酐置于四氢呋喃中，并在冰浴下加入氯乙酰氯，室温搅拌过夜(10-16h)，减压除去溶剂，硅胶柱分离，以二氯甲烷为洗脱剂，减压除去溶剂得4-(2-氯乙酰基)氨基-1,8-萘酐；(4)中间体4-(2-(N,N-二乙基氨基)乙酰基)氨基-1,8-萘酐的合成：将4-(2-氯乙酰基)氨基-1,8-萘酐置于乙腈中，搅拌下加入二乙胺，加热至50-70℃，2-4h，减压除去溶剂，硅胶柱分离，以二氯甲烷：甲醇＝100:1-20:1为洗脱剂，减压除去溶剂得4-(2-(N,N-二乙基氨基)乙酰基)氨基-1,8-萘酐；(5)将4-(2-(N,N-二乙基氨基)乙酰基)氨基-1,8-萘酐溶于乙醇中，搅拌下加入正丁胺，加热至80-90℃，3-6h，减压除去溶剂，得探针1；或，将4-(2-(N,N-二乙基氨基)乙酰基)氨基-1...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐兆超，乔庆龙，苗露，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁,21