一种开关型锌离子荧光探针及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种开关型锌离子荧光探针及其制备方法和应用，其结构为：

【技术实现步骤摘要】
一种开关型锌离子荧光探针及其制备方法和应用
本专利技术属于化学分析检测领域，具体涉及一种开关型锌离子荧光探针、其制备方法及应用。
技术介绍
锌是一种重要的微量元素，在人体中含量仅次于铁。锌不仅是体内多种蛋白质、DNA、RNA及核糖体的重要组成部分，还参与组成3000多个转录因子，同时锌离子是许多酶的活性中心，直接参与人体内多种生理过程。健康的前列腺中富集了大量的锌，其含量是体内所有软性组织中最高的。前列腺癌变前期腺体中的锌离子浓度明显降低，这种锌离子流失在前列腺癌病理变化过程中持续发生。研究发现，锌离子浓度减小早于其它可观察的生理指标变化。大量研究证实，仅前列腺发生癌变时才会发生锌离子浓度降低，炎症和良性增生时前列腺仍然具有富集锌离子的能力。对比不同格里森分数的恶性肿瘤组织发现格里森分数越高(即癌变越严重)的肿瘤组织其富集锌离子的能力越差。因此锌离子极有可能成为一种新的临床用前列腺癌早期诊断标志物。荧光探针能够实时检测活体细胞内物种的分布和浓度变化，已成为细胞生物学和医学领域最为有用的工具。构建针对细胞内锌离子的荧光探针成为近年来的研究热点，其中小分子荧光探针易于透过质膜，对生物体毒性小，能够实时动态检测而成为研究最深入、应用前景也最广阔的一类。然而已报道的锌离子荧光探针无法满足应用于前列腺癌早期诊断的需求。尽管近几年已有两例荧光探针报道用于前列腺癌细胞中锌离子的检测，但它们依然缺乏适于前列腺癌诊断的综合特性，包括对锌离子结合选择性专一、灵敏度高、动态量程宽、响应速度快、荧光信噪比高、定量检测、生物相容性等实体检测要求。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种开关型锌离子荧光探针及其制备方法和应用，该探针对锌离子具有专一的选择性和较高的灵敏度，探针与锌离子结合后信号放大倍数高，制备方法简单，适合放大合成和实际应用。本专利技术提供了一种锌离子荧光探针，该荧光探针结构如下：其中，R1、R2、R3、R4各自独立地选自为H、C1-20烷基、取代烷基、环烷基、取代环烷基、芳基、取代芳基、(CH2CH2O)nH、(CH2)mCOOM和(CH2)mSO3M、杂芳基或取代杂芳基中的一种或二种以上；n、m分别为0-12的整数；M为H、K、Na、Li、NH4、NH3R5、NH2(R5)2、NH(R5)3或N(R5)4；R5为H、C1-20烷基。本专利技术的锌离子探针的合成方法具有原料廉价易得、合成步骤简单、产物易纯化、反应收率高等优点。该类化合物的合成路线如下：具体合成步骤如下：(1)中间体N-(6-甲基吡啶)-2,2-二甲基戊酰胺2的合成2-氨基-6-甲基吡啶和有机碱溶于二氯甲烷中，将新戊酰氯缓慢滴入反应瓶，冰水浴中反应1-3小时，再于室温中反应2-6小时。反应结束后用饱和碳酸氢钠溶液和饱和食盐水洗，有机相干燥、旋干后得到浅黄色蜡状固体。(2)中间体N-(6-溴甲基吡啶)-2,2-二甲基戊酰胺3的合成N-(6-甲基吡啶)-2,2-二甲基戊酰胺溶于四氯化碳，加入偶氮二异丁腈引发剂，氮气保护下加入N-溴代丁二酰亚胺，回流状态下反应3-8小时，反应结束后柱分离得到目标中间体。(3)中间体N-(6-(二吡啶甲基苄胺)吡啶)-2,2-二甲基戊酰胺4的合成无水无氧条件下，N-(6-溴甲基吡啶)-2,2-二甲基戊酰胺、相对于N-(6-溴甲基吡啶)-2,2-二甲基戊酰胺0.8-1倍摩尔量的二甲基吡啶胺、碱和相转移催化剂。N-(6-溴甲基吡啶)-2,2-二甲基戊酰胺与碱和相转移催化剂的质量比为1:1-1.5:0.01-0.05。在在相对于N-(6-溴甲基吡啶)-2,2-二甲基戊酰胺10-20倍质量的乙腈中以81-82℃回流24-48小时。反应结束后降至室温，加入相对乙腈体积0.2-0.6倍体积的1M的氢氧化钠溶液，用二氯甲烷萃取三到五次，合并有机相，干燥后旋干有机相，通过中性硅胶或中性氧化铝柱分离，洗脱剂为二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、氯仿、甲醇、三乙胺、冰醋酸中的一种或二种以上。得到目标中间体N-(6-(二吡啶甲基苄胺)吡啶)-2,2-二甲基戊酰胺；(4)中间体6-(二吡啶甲基苄胺)-2-氨基吡啶5的合成N-(6-(二吡啶甲基苄胺)吡啶)-2,2-二甲基戊酰胺加入酸溶液，100-110℃回流24-48小时，反应结束后加入1M氢氧化钠溶液，调节pH>8。二氯甲烷萃取，合并有机相，干燥，旋干后得到浅黄色固体，用少量乙醚洗后得到目标中间体。(5)新型锌离子荧光探针1的合成罗丹明染料溶于20-30倍质量的1,2-二氯乙烷，加入相对于罗丹明1-1.2倍摩尔量的氯化试剂在83-90℃回流反应3-8小时后，旋干反应液，得到酰氯化罗丹明粗产物6-(二吡啶甲基苄胺)-2-氨基吡啶(中间体5)、酰氯化罗丹明(中间体6)溶于干燥乙腈，在有机碱催化下室温反应12-24小时。反应结束后旋干反应液。(6)新型锌离子荧光探针1的提纯将粗产物通过中性硅胶柱或中性氧化铝柱柱分离提纯得到目标锌离子荧光探针1.3.本专利技术提供的新型锌离子荧光探针的合成方法中，步骤(1)中所述的有机碱指三乙胺、吡啶、哌啶、4-二甲氨基吡啶中至少一种；；所述有机相为二氯甲烷溶液；步骤(1)中，2-氨基-6-甲基吡啶、新戊酰氯和有机碱之间物质的量之比为1:1-1.5:1-1.6，二氯甲烷质量为2-氨基-6-甲基吡啶质量的60-120倍。。4.本专利技术提供的新型锌离子荧光探针的合成方法中，步骤(2)中所述的柱分离采用硅胶分离柱，所用溶剂为二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、氯仿、甲醇、三乙胺、冰醋酸中的一种或二种以上；本专利技术提供的新型锌离子荧光探针的合成方法中，步骤(3)中所述的碱指无机碱碳酸钾、碳酸钠、碳酸铵或有机碱三乙胺、吡啶、哌啶、4-二甲氨基吡啶、N，N-二异丙基乙胺中的一种；本专利技术提供的新型锌离子荧光探针的合成方法中，步骤(3)中所述的相转移催化剂指苄基三乙基氯化铵、四丁基溴化铵、四丁基氯化铵、四丁基硫酸氢铵、三辛基甲基氯化铵、十二烷基三甲基氯化铵、十四烷基三甲基氯化铵中的一种；本专利技术提供的新型锌离子荧光探针的合成方法中，步骤(4)中所述的酸溶液指1-3M盐酸或硫酸溶液；步骤(4)中，酸溶液的质量为N-(6-(二吡啶甲基苄胺)吡啶)-2,2-二甲基戊酰胺质量的600-1200倍。5.本专利技术提供的新型锌离子荧光探针的合成方法中，步骤(5)中所述的氯化试剂指三氯氧磷、二氯亚砜、草酰氯中的一种；步骤(5)中所述的有机碱为三乙胺、吡啶、哌啶、4-二甲氨基吡啶中至少一种；步骤(5)中酰氯化罗丹明与6-(二吡啶甲基苄胺)-2-氨基吡啶物质的量比为1:0.8-1.1。6-(二吡啶甲基苄胺)-2-氨基吡啶与有机胺和乙腈的质量比为1:1.5-3:200-300。。本专利技术提供的新型锌离子荧光探针的合成方法中，步骤(7)中所述的柱分离采用中性氧化铝柱，分离溶剂为二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、氯仿、甲醇、三乙胺、冰醋酸或他们的混合溶剂。本专利技术提供的荧光探针应用在生理条件(pH＝7.4)溶液中锌离子的检测或生物样本中对细胞中的锌离子的检测中。本专利技术具有以下具体特征：探针分子原料易得，合成路线简单、反应条件温和、后处理简单方便，对锌离子识别能力专一，响应速度较快。探针在HEPES(pH＝7.4)溶解性较好，最大发射波长本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种开关型锌离子荧光探针，其特征在于：该荧光探针结构如下：

【技术特征摘要】
1.一种开关型锌离子荧光探针，其特征在于：该荧光探针结构如下：其中，R1、R2、R3、R4分别为H、C1-20烷基、取代烷基、环烷基、取代环烷基、芳基、取代芳基、(CH2CH2O)nH、(CH2)mCOOM、(CH2)mSO3M、杂芳基或取代杂芳基中的一种或二种以上；n、m分别为0-12的整数；M为H、K、Na、Li、NH4、NH3R5、NH2(R5)2、NH(R5)3或N(R5)4；R5为H、C1-20烷基。2.一种权利要求1所述的开关型锌离子荧光探针的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：(1)中间体N-(6-甲基吡啶)-2,2-二甲基戊酰胺的合成2-氨基-6-甲基吡啶和有机碱溶于二氯甲烷中，将新戊酰氯缓慢滴入反应瓶，冰水浴中反应1-3小时，再于室温中反应2-6小时；反应结束后用饱和碳酸氢钠溶液和饱和食盐水洗，有机相干燥、旋干后得到N-(6-甲基吡啶)-2,2-二甲基戊酰胺；(2)中间体N-(6-溴甲基吡啶)-2,2-二甲基戊酰胺的合成N-(6-甲基吡啶)-2,2-二甲基戊酰胺溶于四氯化碳，加入偶氮二异丁腈引发剂，氮气保护下加入N-溴代丁二酰亚胺，回流状态下反应3-8小时，反应结束后柱分离得到目标中间体N-(6-溴甲基吡啶)-2,2-二甲基戊酰胺；(3)中间体N-(6-(二吡啶甲基苄胺)吡啶)-2,2-二甲基戊酰胺的合成无水无氧条件下，N-(6-溴甲基吡啶)-2,2-二甲基戊酰胺、相对于N-(6-溴甲基吡啶)-2,2-二甲基戊酰胺0.8-1倍摩尔量的二甲基吡啶胺、碱和相转移催化剂；N-(6-溴甲基吡啶)-2,2-二甲基戊酰胺与碱和相转移催化剂的质量比为1:1-1.5:0.01-0.05；在相对于N-(6-溴甲基吡啶)-2,2-二甲基戊酰胺10-20倍质量的乙腈中以81-82℃回流24-48小时；反应结束后降至室温，加入相对乙腈体积0.2-0.6倍体积的1M的氢氧化钠溶液，用二氯甲烷萃取三到五次，合并有机相，干燥后旋干有机相，通过柱分离得到目标中间体N-(6-(二吡啶甲基苄胺)吡啶)-2,2-二甲基戊酰胺；(4)中间体6-(二吡啶甲基苄胺)-2-氨基吡啶的合成N-(6-(二吡啶甲基苄胺)吡啶)-2,2-二甲基戊酰胺加入酸溶液，100-110℃回流24-48小时，反应结束后加入1M氢氧化钠溶液，调节pH>8；二氯甲烷萃取，合并有机相，干燥，旋干，用少量乙醚洗，得到目标中间体6-(二吡啶甲基苄胺)-2-氨基吡啶；(5)锌离子荧光探针的合成罗丹明染料溶于20-30倍质量的1,2-二氯乙烷，加入相对于罗丹明1-1.2倍摩尔量的氯化试剂在83-90℃回流反应3-8小时后，旋干反应液，得到酰氯化罗丹明粗...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐兆超，尹文婷，乔庆龙，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁,21