MT基因作为防治AFB制造技术

本发明专利技术公开了MT基因作为防治AFB

The MT gene acts as a control against AFB

The present invention discloses the MT gene as a prevention and cure AFB

【技术实现步骤摘要】
MT基因作为防治AFB1致鸭肝脏损伤靶标基因的应用
本专利技术涉及MT基因的新用途，具体地指MT基因作为防治AFB1致鸭肝脏损伤靶标基因的应用。
技术介绍
饲料中黄曲霉毒素B1(aflatoxinB1,AFB1)污染普遍存在，严重损害动物的健康，降低动物的生产性能，并造成畜产品中黄曲霉毒素的残留，给畜产品的食用安全带来极大隐患。雏鸭是常见畜禽中对AFB1最敏感的物种之一。动物经口摄入AFB1后主要蓄积与肝脏，同时，肝脏也是生物活化AFB1为高毒性AFB1-外8,9-环氧化物(AFBO)的场所，是AFB1危害的主要靶器官，且雏鸭的肝脏损伤具有典型的病理学变化特征。因此，雏鸭原代肝细胞是研究AFB1毒性的理想模型。DNA被AFBO烷基化形成AFB1-8,9-二氢二醇，导致了G→T的突变，被认为是AFB1引起的主要突变(BedardandMassey,2006)。此外，AFB1还能诱导肝脏产生活性氧自由基(ROS)，如超氧阴离子自由基、过氧化氢和脂质过氧化物，它们是羟基自由基的前体物质(HalliwellandGutteridge,1999)，而羟基自由基能攻击DNA上的糖、嘧啶以及嘌呤，而引起DNA氧化损伤，甚至突变(BedardandMassey,2006)。然而，有限的研究发现，AFB1诱导ROS的形成，需要细胞色素P450酶(CYP450)催化形成的AFBO和/或水解产生的AFM1的参与外，还同时需要铁离子参与催化过程和Kupffers细胞的参与(Shenetal.,1996；Towneretal.,2003)。但是，目前关于AFB1引起的氧化应激导致肝脏损伤的机制尚不清楚。AFB1致鸭肝脏损伤与其诱导机体抗氧化能力损伤有关。鸭AFB1中毒造成的肝脏损伤尚无有效的治疗或缓解方法，主要原因在于哪些关键基因参与AFB1诱导鸭肝脏毒性尚不清楚。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术对防治AFB1致家禽肝脏毒性的不足，提供了一种MT基因(金属硫蛋白基因)作为防治AFB1致动物肝脏损伤靶标基因的应用。为了实现上述目的，本专利技术提供了一种MT基因作为防治AFB1致动物肝脏损伤靶标基因的应用，所述MT基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。所述MT基因的编码金属硫蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。金属硫蛋白(metallothionein,MT)的分子功能主要是结合金属离子，在重金属脱毒反应中发挥重要作用(MargoshesandVallee,1957)，同时，越来越多的研究揭示了MT能缓解氧化应激、致癌原对机体的损伤(Shibuyaetal.,2008；FujiwaraandSatoh,2013)、参与细胞凋亡。MT1/2敲除小鼠对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和LPS/半乳糖胺极敏感，动物接触后表现为急性肝功能衰竭(Kimuraetal.,2001；Inoueetal.,2006)。本专利技术运用鸭原代肝细胞为模型，通过鸭原代肝细胞过表达MT基因，检测MT基因在调控AFB1致鸭肝脏毒性作用中的功能。通过MTT试验、细胞凋亡试验、Westernblotting和q-PCR技术，以及检测鸭原代肝细胞内抗氧化能力相关指标和肝细胞中AFBO-DNA含量的变化情况，结果表明MT能有效抑制AFB1致雏鸭肝脏原代细胞损伤的功能，主要通过增强细胞的抗氧化能力、减少AFBO-DNA的生成、及调控抑癌因子和促凋亡相关基因的表达，进而抑制AFB1诱导的肝细胞癌变和凋亡。说明了MT基因在抑制AFB1毒性上作用。通过上述研究发现，AFB1诱导雏鸭肝脏毒性过程中，能极显著下调MT基因的表达，而鸭原代肝细胞过表达MT可极显著抑制AFB1致肝细胞毒性。因此，确定MT基因在AFB1致雏鸭肝脏损伤中起到关键作用。本专利技术提供了一种MT基因在制备防治AFB1致鸭肝脏损伤药物及饲料添加剂中的应用。本专利技术有益效果本专利技术的MT基因能有效抑制或缓解AFB1诱导的雏鸭肝脏毒性作用，主要与其增强肝细胞抗氧化能力有关。本专利技术的MT基因可以作为治疗AFB1致鸭肝脏损伤药物及新型饲料添加剂开发的靶标基因。附图说明图1MT过表达鸭原代肝细胞经AFB1处理后细胞活率的变化；图2MT过表达鸭原代肝细胞经AFB1处理后细胞凋亡率的变化；图3MT过表达鸭原代肝细胞经AFB1处理后MT下游基因mRNA表达量的变化。具体实施方式下面通过实施例的方式进一步说明本专利技术，但并不因此将本专利技术限制在所属的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书中选择。实施例1：AFB1处理正常鸭原代肝细胞和MT过表达鸭原代肝细胞后的细胞抗氧化酶活力的变化用冷PBS溶液冲洗六孔板两次，将各处理组肝细胞收集于1.5mLEP管中，于-80℃冻存。试验时，用液氮磨碎细胞，用4℃生理盐水溶解。SOD、GST、GPX等酶的活性以及MDA含量均按南京建成相关说明书操作，用紫外分光光度计测定。由结果可知50ng/mLAFB1处理肝细胞后(AFB1组)，细胞中GPX和SOD的活性显著低于未经AFB1处理组(对照组)(P＜0.05)，分别比对照组降低了85.2％、45.7％，而以相同浓度AFB1处理MT过表达肝细胞组(MT+A组)，细胞中GPX和SOD的活性显著高于AFB1组(P＜0.05)，分别比AFB1组提高了418.8％、31.9％。且MT+A组GPX的活性与对照组差异不显著。MT+A组MDA含量显著低于对照组(P＜0.05)，但是显著高于AFB1组(P＜0.05)。GST活性在3组间无显著差异。说明肝细胞过表达MT后，细胞的抗氧化能力得到了增强。实施例2：AFB1处理正常鸭原代肝细胞和MT过表达鸭原代肝细胞后的细胞内AFBO-DNA含量的变化AFBO-DNA加合物的测定按照AflatoxinDNAAdductCompetitiveELISAKit(CellBiolabs,Inc.)(AKR-351)说明书规范进行操作。(1)标准曲线制备：将AFBO-DNA标准品进行梯度稀释，配制成浓度为0、0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2、4μg/mL溶液。(2)分别向包被板每孔加50μL样品和AFBO-DNA标品，室温摇床上摇10min。(3)抗体稀释：将AFBO-DNA一抗用AssayDiluent1:500稀释，立即向包被板每孔加入50μL该稀释液，室温振荡摇1h。(4)用洗涤液洗3次，滤纸吸去残留液体。(5)将AFBO-DNA二抗按1:1000比例稀释后，立即向每孔加入100μL该稀释液，室温振荡1h。(6)将底物溶液预热至室温，每孔加100μL，室温下振荡2～20min，出现颜色变化后立即终止反应。(7)每孔加100μL终止液终止反应，用酶标仪以450nm波长处读取数据。(8)根据标准曲线计算样品中AFBO-DNA的浓度。结果以AFBO-DNA/DNA表示。结果表明，正常鸭原代肝细胞组AFBO-DNA加合物含量极低，极显著低于AFB1组(P＜0.001)、极显著低于MT+A组(P＜0.01)，AFB1处理正常鸭原代肝细胞组以及AFB1处理MT过表达亚原代肝细胞组AFBO-DNA加合物含量分别是对照组的43.5倍、14.8倍，且本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种MT基因在防治AFB1致鸭肝脏损伤靶标基因中的应用，其特征在于：所述MT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种MT基因在防治AFB1致鸭肝脏损伤靶标基因中的应用，其特征在于：所述MT基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.根据权利要求1所述的应用...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙铝辉，张妮娅，齐德生，高鑫，赵玲，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42