一种基于化学标记技术的蛋白质同位素稀释串联质谱检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于化学标记技术的蛋白质同位素稀释串联质谱检测方法，包括以下步骤：(1)采用化学标签A对待测样品进行标记，得到标记样品；(2)采用带同位素标记的化学标签iso‑A对内标物进行标记，得到标记内标物；(3)将所述标记样品与标记内标物按照预设比例混匀，得到初样；(4)对初样进行预处理，得到进样样品；(5)将所述进样样品进行质谱检测。本发明专利技术将样品和内标物两种分别标记后，再将两者混合并置于同一反应体系下进行后续的处理工作，使得样品和内标物蛋白质在同一体系中所受到的基质效应、操作误差均相同，使得误差可以得以校正。

【技术实现步骤摘要】
一种基于化学标记技术的蛋白质同位素稀释串联质谱检测方法
本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种基于化学标记技术的蛋白质同位素稀释串联质谱检测方法。
技术介绍
蛋白质的定量分析是生物化学和其他生命学科常涉及的分析内容，在生化实验中，对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析，是经常进行的一项非常重要的工作。但是，由于蛋白质是一种十分重要的生物大分子，它的种类很多，结构不均一，分子量又相差很大，功能各异，这样就给建立一个理想而又通用的蛋白质定量分析的方法带来了许多具体的因难。现有蛋白质的定量方法主要是基于液相色谱质谱联用方法，为了控制、降低由于检测过程中带来的误差，可以在样品制备、检测过程中，加入内标。对于质谱来说，最理想的内标为同位素标记的内标，因为内标与被测物的理化性质完全一样，可以用于评估和校正前处理、色谱分离和离子化环节的误差。在质谱分离中，内标和被测物有显著的分子量(质合比)的差异，不会产生相互干扰。其中蛋白质组学中最常用的标记技术是基于多肽层面的，它的目标在于通过一次操作，能够对所有蛋白质酶解多肽进行标记，通过标记物的同位素形式不同，可以在质谱中将多种多肽/蛋白质进行区分，现有技术中在多肽层面的标记方法包括二甲基法、iTRAQ法、TMT法、ICAT法等，可参见图1。现有基于多肽层面的标记方法进行标记时，存在许多不足，例如第一，多肽层面的标记方法使得两个样品在酶解之后混合，酶解前(提取、净化、还原、烷基化)的所有误差均无法得到校正，降低检测结果的精确度。第二，虽然其中iTRAQ法、TMT法、ICAT法三者均已有商品化试剂，但是商品化的标记试剂约为1000～3000元/反应，价格昂贵。蛋白质的同位素标记技术还包括SILAC技术，其中SILAC蛋白质的生产步骤主要分成两步：(1)将目标蛋白基因转入大肠杆菌中；(2)将大肠杆菌在同位素标记的培养液中培养，使其表达同位素标记的蛋白质。SILAC同位素蛋白质与目标蛋白质具有完全一致的一级结构，理化结构相近，可以在样品提取前加入SILAC蛋白质作为内标，用于校正样品处理、检测过程中的全过程误差。但是SILAC技术存在以下不足：(1)SILAC蛋白合成的价格昂贵，据SILAC合成企业的估价，大约10mgSILAC蛋白质需要20万欧元左右，大约满足数百到一千次样品的检测需求，折合每次检测200～400欧元左右；(2)SILAC蛋白质的生产基于转基因表达技术，由于现有技术限制，不是所有的蛋白质均能成功通过该技术表达出来；(3)正常表达的蛋白质在表达完成后，会进行表达后修饰和蛋白质折叠，而转基因表达的蛋白质不会进行这两个步骤，所以转基因表达的蛋白质在空间结构上与正常表达蛋白质有显著区别。由上述可知，现有蛋白质的同位素标记技术依然存在价格昂贵，操作繁琐，操作过程中存在一定的误差等诸多不足。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种基于化学标记技术的蛋白质同位素稀释串联质谱检测方法，使得操作过程中产生的误差得以校正，而且操作方便，成本较低。本专利技术的技术方案为：一种基于化学标记技术的蛋白质同位素稀释串联质谱检测方法，包括以下步骤：(1)采用化学标签A对待测样品进行标记，得到标记样品；(2)采用带同位素标记的化学标签iso-A对内标物进行标记，得到标记内标物；(3)将所述标记样品与标记内标物按照预设比例混匀，得到初样；(4)对初样进行预处理，得到进样样品；(5)将所述进样样品进行检测。本专利技术中化学标签A与化学标签iso-A为相同的标记物质，化学标签iso-A与化学标签A的不同之处在于，化学标签iso-A与化学标签A上的其中一种或多种化学元素互为同位素。本专利技术的标记方法基于蛋白质层面，本专利技术将待测样品和内标物分别采用化学标签A和带同位素标记的化学标签iso-A标记后，再将两者混合并置于同一反应体系下进行后续的处理工作，使得待测样品和内标物在同一体系中所受到的基质效应、操作误差均相同，使得误差可以得以校正。天然蛋白质具有一定的空间结构，形成或疏或密的三维结构。作为优选，所述步骤(1)中采用化学标签A对待测样品进行标记之前，将待测样品进行蛋白质变性处理。经由蛋白质变性处理可以破坏蛋白质中固定其空间结构的键，使结构松散，可以使得化学标签结合位点暴露出来，让化学标签A易于接触到其结合位点，增加化学标签结合率。作为优选，所述步骤(1)中蛋白质变性处理方法包括有机试剂变性处理方法、无机盐变性处理方法、酸处理变性处理方法、碱处理变性处理方法、破坏氢键变性处理方法、破坏非共价键变性处理方法、还原二硫键变性处理方法、加热变性处理方法、超声处理变性处理方法以及加入表面活性剂变性处理方法中的一种或一种以上变性处理方法的组合。作为优选，所述标记内标物和标记样品之间的分子量大于等于4Da。过小的分子量差异会导致同位素标记产物和非同位素标记产物的天然同位素重叠，导致结果相互干扰。化学标签iso-A可同位素标记的位点过少，可以通过增加化学标签的种类和数量达到这一目的。本专利技术基于蛋白质层面的标记，而蛋白质由多个不同种类的氨基酸组成，本专利技术中可以选择的标记物有多种，因此相比于多肽层面的标记方法来说，本专利技术的适用性更广，作为优选，所述化学标签A为甲醛和氰基硼氢化物组成的标记组份、碘代乙酰胺、1，2-环己二酮、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、甘氨酰胺、碘代乙酰胺、焦碳酸二乙酯、琥珀酰酐、2-羟基-5-硝基苄溴以及四硝基甲烷中的至少一种组份。根据上述优选标记组份，化学标签A的作用位点可广泛分布于20种常见氨基酸中的16种，包括精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸。广泛的候选氨基酸侧链增加了本专利技术的适用范围，可以基本覆盖所有多肽可能性。作为优选，所述标记位点为精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸中至少一种氨基酸的侧链。本专利技术中步骤(4)中的预处理方法可以有多种，作为优选，所述步骤(4)中的预处理方法包括二硫键还原、半胱氨酸烷基化、非共价键断裂、翻译后修饰消除、蛋白酶解反应、蛋白质净化、多肽净化以及稀释处理方法中的一种或者一种以上处理方法的组合。化学标签标记后的内标物和化学标签标记后的待测样品处于同一反应体系下，其反应效率一致，可以用于互相校正基质效应对预处理带来的干扰，也可用于相互校正后续质谱检测中的基质效应问题。质谱检测技术对多肽长度有一定要求，过短的多肽(少于6个氨基酸)的特异性小，易产生交叉反应；过长的多肽(大于20个氨基酸)在质谱检测中离子化效率低，多重电荷现象严重，导致灵敏度低。同时，氨基酸侧链与化学标签结合后，会影响部分以此为酶切位点的蛋白酶活性。作为优选，所述步骤(4)中的预处理方法包括蛋白酶解反应，所述蛋白酶解反应中的蛋白酶包括碱性胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、弹性蛋白酶、蛋白质酶K、Rhizopuspepsin、CysN、LysC、LysN、ArgC、ArgN、AspC、AspN、GluC、TyrC、ProC、ProN、V8蛋白酶中的一种或者一种以上。该蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于化学标记技术的蛋白质同位素稀释串联质谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采用化学标签A对待测样品进行标记，得到标记样品；(2)采用带同位素标记的化学标签iso‑A对内标物进行标记，得到标记内标物；(3)将所述标记样品与标记内标物按照预设比例混匀，得到初样；(4)对初样进行预处理，得到进样样品；(5)将所述进样样品进行检测。

【技术特征摘要】
1.一种基于化学标记技术的蛋白质同位素稀释串联质谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采用化学标签A对待测样品进行标记，得到标记样品；(2)采用带同位素标记的化学标签iso-A对内标物进行标记，得到标记内标物；(3)将所述标记样品与标记内标物按照预设比例混匀，得到初样；(4)对初样进行预处理，得到进样样品；(5)将所述进样样品进行检测。2.如权利要求1所述的基于化学标记技术的蛋白质同位素稀释串联质谱检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中采用化学标签A对待测样品进行标记之前，将待测样品进行蛋白质变性处理。3.如权利要求2所述的基于化学标记技术的蛋白质同位素稀释串联质谱检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中蛋白质变性处理方法包括有机试剂变性处理方法、无机盐变性处理方法、酸处理变性处理方法、碱处理变性处理方法、破坏氢键变性处理方法、破坏非共价键变性处理方法、还原二硫键变性处理方法、加热变性处理方法、超声处理变性处理方法、加入表面活性剂变性处理方法中的一种或一种以上变性处理方法的组合。4.如权利要求1所述的基于化学标记技术的蛋白质同位素稀释串联质谱检测方法，其特征在于，所述标记内标物和标记样品之间的分子量大于等于4Da。5.如权利要求1所述的基于化学标记技术的蛋白质同位素稀释串联质谱检测方法，其特征在于，所述化学标签A为甲醛和氰基硼氢化物组成的标记组份、碘代乙酰胺、1，2-环己二酮、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、甘氨酰胺、碘代乙酰胺、焦碳酸二乙酯、琥珀酰酐、2-羟基-5-...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈启，郝星凯，王川丕，章舒褀，章虎，谷建潮，
申请(专利权)人：绿城农科检测技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33