液体发酵灵芝菌丝体三萜含量的近红外光谱定量测定方法技术

本发明专利技术公开了一种液体发酵灵芝菌丝体三萜含量的近红外光谱定量测定方法，包括如下步骤：(1)利用液体发酵方式获得灵芝菌丝体及其干粉；(2)将样品分为校正集和验证集；(3)对于校正集样品，利用高氯酸‑香草醛分光光度法进行定量测定；(4)对灵芝菌丝体干粉进行近红外光谱检测，并收集光谱数据；(5)对近红外光谱进行预处理；(6)利用校正集的高氯酸‑香草醛法测量结果和近红外光谱构建定量模型；(7)将验证集的测量光谱导入上述三萜含量定量模型，对其三萜含量进行预测。本发明专利技术的优点在于：提供了一种稳定高效的液体发酵灵芝菌丝体三萜含量的近红外光谱定量测定方法，对灵芝品种选育和灵芝三萜含量的工业生产有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
液体发酵灵芝菌丝体三萜含量的近红外光谱定量测定方法
本专利技术涉及近红外光谱定量测定方法领域，尤其涉及一种液体发酵灵芝菌丝体三萜含量的近红外光谱定量测定方法。
技术介绍
灵芝(GanodermaLucidum)是我国的传统中药，并被收录于中国药典和美国草药药典。其所具有的抗肿瘤，抗肝炎、抗高血压、糖尿病等功能与其中的灵芝三萜及灵芝多糖成分密切相关。因此，灵芝三萜是灵芝中重要的药效成分。灵芝三萜种类繁多，目前已经发现的灵芝属萜类化合物已经达到一百种以上。随着灵芝产业的发展，原有的粗放的灵芝子实体生产模式效益下降，特别是在灵芝产品深加工和药用成分分离纯化领域。用子实体进行分离纯化工作，有以下困难：一是环境条件受到限制，大部分种类灵芝子实体生长需要高温高湿环境，自然条件下生长周期繁育受到限制，如果要人为干预，需要较大的前期成本投入；二是生产周期长，即便在温度、湿度、土壤环境都非常适宜的情况下，灵芝子实体的生长通常要几个月时间，单纯通过生产灵芝子实体，销售产出投入比很低；三是采用产品深加工，活性药用成分分离纯化方法，产品附加值很高，但对于子实体而言，在灵芝多糖和三萜等有效成分分离纯化过程中，需要耗费大量的经济和时间成本脱去表面坚硬的皮层。所以，人们正在不断寻找其他途径获取灵芝活性药用成分，利用液体深层发酵技术就是获取灵芝活性药用成分的有效途径之一。灵芝菌丝体液体发酵具有生产周期短，一次发酵罐发酵通常只需要4-7天时间；发酵过程不受季节限制，且发酵生产过程可控，菌丝体生长质量有保障；菌丝体中不存在大量的纤维素、半纤维素、木质素等成分，没有子实体的脱皮环节，非常适合药用成分的分离纯化。但是，在灵芝子实体和菌丝体生产过程中，需要对其质量进行实时有效监控。以往对灵芝三萜含量的定量分析主要有分光光度法、高效液相色谱法、薄层层析法等，这些方法作为传统的化学检测方法，其共同的缺点是检测时间较长、成本较高、所用化学试剂会造成污染、样品有损失等。而利用近红外光谱技术进行检测，具有便捷、无损和高通量的检测特点，结合计算机技术未来有望实现在线检测。虽然近红外光谱技术具有上述优点，但需要构建稳定高效的定量分析模型。目前只有灵芝子实体的三萜的近红外定量模型，而灵芝子实体和菌丝体之间在结构(有无皮层)和成分组成(纤维素、半纤维素、木质素含量)上有很大差别，这些会使两种近红外光谱存在较大差异。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种稳定高效的的液体发酵灵芝菌丝体三萜含量的近红外光谱定量测定方法。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种液体发酵灵芝菌丝体三萜含量的近红外光谱定量测定方法，包括如下步骤：(1)利用液体发酵方式获得灵芝菌丝体，并制备灵芝菌丝体干粉；(2)将灵芝菌丝体干粉样品分为校正集和验证集；(3)对于校正集的灵芝菌丝体干粉，利用高氯酸-香草醛分光光度法进行定量测定；(4)对灵芝菌丝体干粉进行近红外光谱检测，波数范围为12500-4000cm-1，并收集光谱数据；(5)对收集的近红外光谱进行预处理；(6)利用校正集的高氯酸-香草醛法测量结果和近红外光谱构建定量模型，对光谱谱段进行化学计量学分析，选出与三萜含量相关性高的近红外光谱峰区，获得相应定量分析模型；(7)将验证集的测量光谱导入上述三萜含量定量模型，对其三萜含量进行预测。作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(1)中灵芝菌丝体及其干粉的具体制备方法为：将灵芝种子培养基中的菌丝体接种于灭菌后的马铃薯葡萄糖液体培养基中，于26-30℃，140-160rpm转速摇床震荡培养；5-10d菌丝体长满培养基，将菌丝体连同菌液取出，离心后用ddH2O清洗菌丝体；置于烘箱中45-60℃干燥，干燥后粉碎成干粉末状，筛后以备后续检测。作为本专利技术的优选方式之一，所述种子培养基的配方为：200g/L马铃薯+20g/L葡萄糖+(10-15)g/L琼脂+1000mLddH2O，pH7.0；所述马铃薯葡萄糖液体培养基的配方为：200g/L马铃薯+20g/L葡萄糖+1000mLddH2O，pH7.0。作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(2)中灵芝菌丝体干粉样品的校正集和验证集的数量相同，校正集和验证集的分类形式为随机采样分类。作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(3)中高氯酸-香草醛分光光度法测定校正集的灵芝菌丝体干粉的具体方法为：(1)量取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL对照品溶液，即0.2mg齐墩果酸/mL甲醇溶液，分别置于15mL具塞试管中，挥干，放冷，加入0.2mL香草醛冰醋酸溶液、0.8mL高氯酸，摇匀，再于68-72℃水浴中加热14-16min，立即置冰浴中冷却4-6min，取出，加入4mL乙酸乙酯，摇匀；以相应试剂为空白，采用紫外-可见分光光度法，在546nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线；(2)取0.2mL供试品溶液，即灵芝三萜乙醇提取液，置15mL具塞试管中，接着，采用上述对照品溶液的处理与吸光度测量方法，测定供试品溶液的相应吸光度，再通过标准曲线读出供试品溶液中齐墩果酸的含量，结果为每100mg样本干品中含有的齐墩果酸质量(mg)，以％表示。作为本专利技术的优选方式之一，所述香草醛冰醋酸溶液的制备方法为：称取香草醛0.5g，再加入冰醋酸使之溶解成10mL。作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(4)中近红外光谱检测具体为近红外漫反射光谱检测，波数范围为12500-400cm-1，分辨率16cm-1，扫描次数32次，利用积分球聚集光信号，InGaAs检测器检测，每份样品采集2次光谱，取其平均光谱作为样品原始光谱。作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(5)中预处理方式为：将测量光谱在12500-9000cm-1范围内截除，保留9000-4000cm-1光谱范围，再进行矢量归一化和一阶导数处理。作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(6)中化学计量学分析的方法为：采用OPUS光谱分析软件及PLS程序对光谱谱段进行化学计量学处理；所述与三萜含量相关性高的近红外光谱峰区为：9000-7984.3cm-1、5909.1-5577.4cm-1和4898.6-4000cm-1三个近红外光谱峰区。作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(6)中与三萜含量相关性高的近红外光谱峰区为：9000-7984.3cm-1、5909.1-5577.4cm-1和4898.6-4000cm-1三个近红外光谱峰区。本专利技术相比现有技术的优点在于：本专利技术利用近红外光谱技术，结合高氯酸-香草醛法测定的结果，对液体发酵的灵芝菌丝体三萜含量构建数学模型，以便建立稳定高效的基于近红外光谱技术的灵芝菌丝体发酵三萜含量定量方法，该方法将对灵芝品种选育和灵芝三萜含量的工业生产有重要意义。附图说明图1是实施例1中灵芝菌丝体干粉近红外光谱检测原始光谱图；图2是实施例1中原始光谱图经预处理、化学计量学处理后选取的波段范围；图3是实施例1中优化得到的灵芝菌丝体三萜含量近红外光谱定量模型；图4是实施例1中将验证集的测量光谱导入三萜含量定量模型后的验证结果图。具体实施方式下面对本专利技术的实施例作详细说明，本实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本专利技术的保护范围不限于下述的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种液体发酵灵芝菌丝体三萜含量的近红外光谱定量测定方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)利用液体发酵方式获得灵芝菌丝体，并制备灵芝菌丝体干粉；(2)将灵芝菌丝体干粉样品分为校正集和验证集；(3)对于校正集的灵芝菌丝体干粉，利用高氯酸‑香草醛分光光度法进行定量测定；(4)对灵芝菌丝体干粉进行近红外光谱检测，波数范围为12500‑4000cm

【技术特征摘要】
1.一种液体发酵灵芝菌丝体三萜含量的近红外光谱定量测定方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)利用液体发酵方式获得灵芝菌丝体，并制备灵芝菌丝体干粉；(2)将灵芝菌丝体干粉样品分为校正集和验证集；(3)对于校正集的灵芝菌丝体干粉，利用高氯酸-香草醛分光光度法进行定量测定；(4)对灵芝菌丝体干粉进行近红外光谱检测，波数范围为12500-4000cm-1，并收集光谱数据；(5)对收集的近红外光谱进行预处理；(6)利用校正集的高氯酸-香草醛法测量结果和近红外光谱构建定量模型，对光谱谱段进行化学计量学分析，选出与三萜含量相关性高的近红外光谱峰区，获得相应定量分析模型；(7)将验证集的测量光谱导入上述三萜含量定量模型，对其三萜含量进行预测。2.根据权利要求1所述的液体发酵灵芝菌丝体三萜含量的近红外光谱定量测定方法，其特征在于，所述步骤(1)中灵芝菌丝体及其干粉的具体制备方法为：将灵芝种子培养基中的菌丝体接种于灭菌后的马铃薯葡萄糖液体培养基中，于26-30℃，140-160rpm转速摇床震荡培养；5-10d菌丝体长满培养基，将菌丝体连同菌液取出，离心后用ddH2O清洗菌丝体；置于烘箱中45-60℃干燥，干燥后粉碎成干粉末状，筛后以备后续检测。3.根据权利要求2所述的液体发酵灵芝菌丝体三萜含量的近红外光谱定量测定方法，其特征在于，所述种子培养基的配方为：200g/L马铃薯+20g/L葡萄糖+(10-15)g/L琼脂+1000mLddH2O，pH7.0；所述马铃薯葡萄糖液体培养基的配方为：200g/L马铃薯+20g/L葡萄糖+1000mLddH2O，pH7.0。4.根据权利要求1所述的液体发酵灵芝菌丝体三萜含量的近红外光谱定量测定方法，其特征在于，所述步骤(2)中灵芝菌丝体干粉样品的校正集和验证集的数量相同，校正集和验证集的分类形式为随机采样分类。5.根据权利要求1所述的液体发酵灵芝菌丝体三萜含量的近红外光谱定量测定方法，其特征在于，所述步骤(3)中高氯酸-香草醛分光光度法测定校正集的灵芝菌丝体干粉的具体方法为：(1)量取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL对照品溶液，即0.2m...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄青，马玉涵，何华奇，姚国华，
申请(专利权)人：中国科学院合肥物质科学研究院，
类型：发明
国别省市：安徽,34