本发明专利技术公开了一种焦磷酸测序法检测TRIB3基因多态性试剂盒及方法。TRIB3基因多态性具体是指rs2295490单核苷酸多态性。试剂盒包含如SEQ ID NO.1—3所示的引物、2×Premix预液、DNA模板等。本发明专利技术的试剂盒，可以实现准确、快捷、高通量TRIB3(rs2295490)的检测，从而达到对2型糖尿病个体化治疗方案制定，心血管疾病获益预测及防范低血糖事件发生。
【技术实现步骤摘要】
焦磷酸测序法检测TRIB3基因多态性的试剂盒及方法
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及焦磷酸测序法检测TRIB3基因多态性的试剂盒及方法。
技术介绍
糖尿病是我国及全球面临的最严重、最危急的健康问题之一。糖尿病患病人数逐年递增，并产生影响终生的并发症。据国际糖尿病联盟(IDF)统计，2015年全球约4.15亿糖尿病患者，占世界人口比例的8.8％，另有3.18亿成年人处于糖耐量受损状态，而糖耐量受损是未来糖尿病发生的高危因素。中国人群糖尿病患病率为9.8％，患病人数约1.10亿，未诊断糖尿病患者约0.57亿，高居世界首位。值得关注的是，糖尿病导致的并发症是致残、降低生活质量和导致早亡的主要原因。2015年我国死于糖尿病患者高达129.97万人，用于糖尿病及其并发症的医疗费用占总医疗费用的13％，其中糖尿病血管并发症是致死及高额医疗支出的首要原因。Tribblespseudo-kinase3(TRIB3)是一个假激酶，能与Akt结合并抑制胰岛素介导的Akt磷酸化激活诱导葡萄糖稳态水平的损伤。临床研究表明TRIB3过度激活或TRIB3(rs2295490,A>G)基因突变与2型糖尿病患者胰岛耐受及其心血管并发症风险增加显著相关。动物实验研究表明缬沙坦(降压药物)能够显著下调糖尿病心肌肥厚小鼠TRIB3mRNA水平及改善心肌功能。体外研究表明TRIB3(rs2295490,A>G)基因多态性不影响胰岛素介导IR，TIS.1的激活，也不影响TRIB3蛋白水平，但影响Akt(Thr308,Ser473)和eNOS(Ser1177)磷酸激活，进而导致胰岛素刺激HUVEC细胞一氧化氮生成降低3倍左右。近期，我们的大样本5年随访临床研究表明，TRIB3(rs2295490,A>G)G等位基因频率为17.1％。对年龄大于55岁，接受标准糖化血糖控制(遵医嘱治疗，HbA1c约为7.3％)的2型糖尿病患者，AG/GG基因型携带者主要大血管及微血管事件患病风险显著增加。相反，接受强化血糖控制(HbA1c≤6.5％)的2型糖尿病患者，主要大血管及微血管事件患病风险显著降低(IntensivevsStandard*AG/GG:HR＝0.58(0.42–0.79),P＝0.001)。而对AA基因携带者，强化血糖控制并无显著心血管疾病获益(IntensivevsStandard*AA:HR＝1.04(0.83-1.31),P＝0.72)。提示对该突变位点检测对2型糖尿病个体化治疗方案制定，心血管疾病获益预测及降低低血糖事件发生具有重要临床意义。综上所述，TRIB3基因多态性与2型糖尿病并发主要大血管及微血管事件显著相关，开发快速、高效、准确、便捷、经济的检测TRIB3基因多态性的试剂盒将为2型糖尿病个体化治疗起到积极的推动作用。焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术是新一代DNA序列分析技术，该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，是一种通用型技术平台。该技术具有操作简便、检测成本低、所需样品量小、快捷、准确、高通量等特点，符合临床大样本检测要求。
技术实现思路
TRIB3基因多态性是与2型糖尿病并发主要大血管及微血管事件显著相关。本专利技术提供一种检测2型糖尿病易感基因TRIB3基因多态性的试剂盒及方法，以实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测TRIB3基因多态性。为了达到上述目的，本专利技术提供的技术方案为：所述焦磷酸测序法检测TRIB3基因多态性的试剂盒包括如下引物：(1)扩增引物：TRIB3(rs2295490)上游引物：5′-GATCGTGCAACTGCTGTGG-3′(SEQIDNO.1)；TRIB3(rs2295490)下游引物：5′-TCCCAGGCCTCCTGTGGT-3′(SEQIDNO.2)；其中，下游引物的5'-进行生物素标记；(2)测序引物：TRIB3(rs2295490)测序引物：5′-GGGCGGGCGGGCCTA-3′(SEQIDNO.3)；试剂盒中其他试剂及溶液为PCR和DNA焦磷酸测序的常规试剂。所述应用上述试剂盒检测TRIB3基因多态性的方法，包括如下步骤：(1)DNA提取；(2)聚合酶链反应：配制50μlPCR扩增体系，包含：2×Premix25μl，ddH2O23μl，模板2μl，其中，所述2×Premix中含有TRIB3(rs2295490)上游引物和TRIB3(rs2295490)下游引物；然后依次在95℃30S，55℃30S，72℃30S进行35个循环，再在72℃保持5min，最终保持在18℃，得扩增产物；(3)对扩增产物进行纯化；(4)对经步骤(3)处理后的扩增产物焦磷酸测序及结果分析。本专利技术的试剂盒对TRIB3(rs2295490)目标序列进行分析和检测。由于设计了特异性高的引物，并且选择了合适的方法，本专利技术的试剂盒适用于对TRIB3基因多态性进行快速检测，可广泛应用于临床上2型糖尿病并发症关联基因TRIB3基因检测。与现有技术相比，其应用焦磷酸测序技术可以快速、准确地进行短DNA序列分析，便于构建标准化操作流程；具有高通量、低成本等特点；PCR产物即可直接用于测序，不需进行产物纯化等二次处理，操作极为简便，所需样品量小。本专利技术所述试剂盒可用于制备2型糖尿病心血管并发症的预后判断试剂。具体实施方式1、确定TRIB3需要检测的具体突变类型，通过检索获取突变位点及其附近的碱基序列；2、设计并合成针对每一个位点的PCR扩增和测序引物，如下：TRIB3(rs2295490)上游引物：5′-GATCGTGCAACTGCTGTGG-3′(SEQIDNO.1)；TRIB3(rs2295490)下游引物：5′-TCCCAGGCCTCCTGTGGT-3′(SEQIDNO.2)；其中，下游引物的5'-进行生物素标记；TRIB3(rs2295490)测序引物：5′-GGGCGGGCGGGCCTA-3′(SEQIDNO.3)；3、提取待测血液样本的DNA并进行浓度和纯度的质检；4、通过质检的DNA样本使用扩增引物进行PCR扩增，步骤如下：(1)操作人员根据实验需要从冰箱中拿取适量的TRIB3PCR-焦磷酸测序2×Premix预混液。根据实验需求准备好无菌的200uL离心管并做好唯一性标记；(2)每个反应管按表1所列加入需求的试剂，其中ddH2O可以根据模板的实际需要量进行调整：表1将配制好的反应管于Eppendorf微量离心机上短暂离心10秒。(3)将上述反应管转移至核酸制备间内。在的专用生物安全柜中往上述反应管中添加模板或ddH2O，加样内容参见表2：表2序号反应管名称添加物添加量(uL)1日期-PC阳性标准品(100ng/ul)22日期-NTCddH2O23样品1唯一性编号样品1DNA模板2N样品N唯一性编号样品NDNA模板2(3)在扩增区按表3条件进行PCR扩增反应：表35、扩增后的产物使用琼脂糖凝胶电泳进行质控；6、通过质控的产物进行焦磷酸测序，步骤如下：(1)扩增产物进行单链样本纯化和与TRIB3测序引物退火结合处理。纯化后的单链模板调用检测程序进行焦磷酸测序检测；(2)依据软件给出的Histograms图，人工对检测结果进行基因型判断，也可以利用软件自动判本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种焦磷酸测序法检测TRIB3基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如下引物：(1)扩增引物：上游引物：5′‑GATCGTGCAACTGCTGTGG‑3′；下游引物：5′‑TCCCAGGCCTCCTGTGGT‑3′；所述下游引物的5'‑进行生物素标记；(2)测序引物：5′‑GGGCGGGCGGGCCTA‑3′。
【技术特征摘要】
1.一种焦磷酸测序法检测TRIB3基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如下引物：(1)扩增引物：上游引物：5′-GATCGTGCAACTGCTGTGG-3′；下游引物：5′-TCCCAGGCCTCCTGTGGT-3′；所述下游引物的5'-进行生物素标记；(2)测序引物：5′-GGGCGGGCGGGCCTA-3′。2.一种应用权利要求1所述的试剂盒检测TRIB3基因多态性的方法，包括如下步骤：(1)DNA提取；(2)聚合酶链反应...
【专利技术属性】
技术研发人员：张伟，何发忠，周杰灿，
申请(专利权)人：张伟，
类型：发明
国别省市：湖南,43
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