源于多氯联苯降解菌的双加氧酶基因及其应用制造技术

本发明专利技术涉及微生物基因工程领域，公开了一种源于多氯联苯降解菌的双加氧酶基因，基因的碱基序列如SEQ ID No.1所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。基因的名称是bphC2基因，其编码阅读框由903bp碱基组成，编码成一个300个氨基酸的蛋白质。还公开了该基因在多氯联苯和联苯类物质降解中的应用，应用的方式包括用于基因工程菌的构建，双加氧酶的制备和获取利用，作为材料用于环境监测。本发明专利技术的基因和蛋白可用于制备降解多氯联苯和其它联苯类物质的基因工程菌，有望应用于多氯联苯污染土壤的修复，在环境污染治理和保护人们身体健康方面发挥作用。

【技术实现步骤摘要】
源于多氯联苯降解菌的双加氧酶基因及其应用
本专利技术涉及微生物基因工程领域，具体涉及一种源于多氯联苯降解菌的双加氧酶基因；还涉及了该基因在多氯联苯和联苯类物质降解中的应用。
技术介绍
多氯联苯(polychlorinatedbiphenyls，PCBs)是被联合国环境规划署(UNEP)首批列入斯德哥尔摩公约受控名单的12种持久性有机污染物(PersistentOrganicPollutants，POPs)之一。多氯联苯与常规污染物不同，它在自然界中极难降解，并在全球范围内长距离迁移，被生物体吸收后不易分解，并沿食物链放大，不仅具有致癌、致畸、致突变性，而且还干扰内分泌系统，对人体健康危害巨大(李国刚，2004)。据WHO统计，全世界共生产了2×106t工业PCBs。我国1965-1974年共生产10000t工业PCBs，其中PCB39000t，PCB51000t(刘静，2006)。1968年在日本以及1979年在台湾都曾发生过因食用受多氯联苯污染的食物而导致上千人中毒的事件(“米糠油”事件)(石碧清，2005)。2005年，我国正式启动实施了全球第一个POPs履约示范项目——“中国多氯联苯管理与处置示范项目”。虽然在政府和职能部门的大力推进下，PCBs的清理处置工作取得了很大的进展，但由于污染范围广、污染时间长，今后的工作仍然任重道远，尤其在处置技术方面还缺乏经济有效的方法，比如土壤生物修复技术由于缺少高效PCBs降解菌等而无法实施，必须考虑构建基因工程菌以提高降解效率，而构建基因工程菌的前提是获得尽可能多的降解酶基因资源并探明其功能。因此开展这方面的理论和应用技术研究，不仅具有重要的学术价值，更具有重大的现实意义。研究表明，绝大多数PCBs降解菌能以联苯为共代谢机质降解更多氯原子的PCBs，并将此途径称为bph途径。bph基因是PCBs降解途径上游的功能基因，在许多革兰氏阴性菌中都显示了联苯代谢基因的保守性(AbramowiczDA.，1995)，降解PCB的前三步酶的编码基因:bphA(联苯双加氧酶)、bphB(联苯二氢二醇脱氢酶)、bphC(2，3-二羟基联苯双加氧酶)呈bphABC的排列方式，而革兰氏阳性菌Rhodococcussp.RHA1呈bphACB的排列方式(SakaiM.，2003)。Furukawa和Miyazaki于1986年首先克隆得到一段来自假单胞细菌(Pseudomonaspseudoalcaligenes)KF707的基因簇，他们发现这些基因簇翻译表达联苯降解途径中3个连续的相关酶(FurukawaK.，1986)。接着，Mondello从BurkholderiaxenovoransLB400(Pseudomonassp.LB400)细菌中克隆得到整个联苯代谢途径所涉及到的基因(MondelloF.J.，1989)。其他实验室也从各类革兰氏阴性(TairaK.，1988；YatesJ.R.，1989；KimbaraK.，1989；HayaseN.，1990；AhmadD.，1990；EricksonB.D.，1992；HoferB.，1993；FukudaM.，1994；HoferB.，1994；KikuchiY.，1994；SylvestreM.，1996)或革兰氏阳性(MaedM.，1995；KosonoS.，1997；AsturiasJ.A.，1993；PeloquinL.，1993；MasaiE.，1995；WangY.，1995；HauschildJ.E.，1996；SakaiM.，2003)细菌菌株中分离得到了能够进行PCB降解的基因。国内外研究的多氯联苯降解酶，主要是指bph途径中涉及的酶。如联苯双加氧酶，2，3-二羟基联苯-1，2-双加氧酶或铁氧化还原蛋白酶(SylvestreM.，2009)。Haddock等人分离纯化得到了来自LB400菌株的多元酶体系(HaddockJ.D.，1995；HaddockJ.D.，1995；BroadusR.M.，1998)。通过X射线晶体衍射，人们也对联苯双加氧酶组件的三维立体结构(ImbeaultN.Y.，2000；NagarajanV.，2003；ColbertC.L.，2000；SendaT.，2000)，2，3-二羟基联苯双加氧酶(HanS.,1995；SendaT.,1996；SugiyamaK.,1995；UragamiY.,2001)以及其他参与联苯代谢途径的酶展开了研究。近年来，人们通过基因工程和生化工程已经对PCBs的好氧降解途径，酶催化作用的特异性底物和关键酶以及不同异化代谢途径等方面有了较详尽的研究。尽管人们通过优化关键酶或重组代谢途径等方式来优化PCB降解效率，但显然还没有一个真正高效的技术。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的缺点，提供了一种源于多氯联苯降解菌的双加氧酶基因，还公开了该基因在多氯联苯和联苯类物质降解中的应用。为了解决上述技术问题，本专利技术通过下述技术方案得以解决：源于多氯联苯降解菌的双加氧酶基因，其碱基序列如SEQIDNo1所示。本专利技术中的双加氧酶基因和蛋白可用于制备降解多氯联苯和其它联苯类物质的基因工程菌，有望应用于多氯联苯污染土壤的修复，在环境污染治理和保护人们身体健康方面发挥作用。作为优选，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNo2所示。作为优选，还包括双加氧酶基因，双加氧酶基因为bphC2基因。作为优选，bphC2基因编码阅读框包括903bp碱基，编码成含有300个氨基酸的蛋白质。以上提到的源于多氯联苯降解菌的双加氧酶基因在多氯联苯和联苯类物质降解中的应用。作为优选，用于基因工程菌的构建。作为优选，用于双加氧酶的制备及利用。作为优选，作为材料用于环境监测。以上提到的源于多氯联苯降解菌的双加氧酶基因的制备方法，包括以下步骤：(1)多氯联苯降解菌WB1染色体总DNA的提取：多氯联苯降解菌WB1提前两天划平板活化，挑取单菌落接种于5ml的试管，37℃剧烈振荡培养过夜，10％的接种量转接至50mlLB液体培养基摇至稳定期(>108cfu/ml)，12000rpm离心5分钟，TEN洗涤菌体，离心收集菌体，悬浮于10ml的TEN中，加入50μL的蛋白酶K(20mg/ml)，再加入1ml的质量分数为10％的SDS，在50℃的温水浴保温3小时，加入1/3体积的饱和NaCl溶液剧烈振荡15秒，12000rpm离心5min，上清液用体积比为1:1的酚：氯仿溶液抽提两次，12000rpm离心5min收集上清液，加入0.6体积的异丙醇沉淀，质量分数为70％的乙醇洗涤，吹干，溶于TER中，备用。2)基因组文库的构建将多氯联苯降解菌WB1总DNA用Sau3AI酶切，回收2～4kb的酶切片段，与用限制性内切酶BamHI彻底酶切并进行脱磷处理的pUC18质粒以大约摩尔比2：1的混合，16℃连接反应12小时以上。酶连产物转化大肠杆菌DH5α高效感受态细胞，涂布于LB/AMP平板，构建了WB1菌株基因组文库。3)筛选降解多氯联苯的转化子挑取上述平板上的转化子菌落，接入加有2,3-二羟基联苯(DHBP)的酶标板中，37℃，15min，挑选有黄色产物(HOPD)生成的阳性克隆。4)序列测定将上述阳性本文档来自技高网...

【技术保护点】
源于多氯联苯降解菌的双加氧酶基因，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID No1所示。

【技术特征摘要】
1.源于多氯联苯降解菌的双加氧酶基因，其特征在于，其碱基序列如SEQIDNo1所示。2.根据权利要求1所述的源于多氯联苯降解菌的双加氧酶基因，其特征在于，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNo2所示。3.根据权利要求1或2所述的源于多氯联苯降解菌的双加氧酶基因，其特征在于，还包括双加氧酶基因，双加氧酶基因为bphC2基因。4.根据权利要求3所述的源于多氯联苯降解菌的双加氧酶基因，其特征在于，bphC2基因编码阅读框包括903bp碱基，编码成含有300个氨基酸的蛋白质。...

【专利技术属性】
技术研发人员：许育新，喻曼，沈阿林，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：浙江,33