一种可以裂解大肠杆菌及沙门氏菌的噬菌体裂解酶的制备方法技术

本发明专利技术属于动物生物医药工程领域，具体公开了一种可以裂解大肠杆菌及沙门氏菌的噬菌体裂解酶的制备方法，通过设计引物，PCR成功扩增出噬菌体ECGD1的裂解酶基因，并转入表达系统获得重组菌。重组菌以IPTG诱导获得表达，诱导后将菌体裂解获得可溶性的噬菌体ECGD1的重组裂解酶，该重组裂解酶可以裂解多株大肠杆菌及沙门氏菌，即具有较宽的裂解谱。此外，重组裂解酶与多粘菌素B协同作用结果显示，重组裂解酶的存在降低了多粘菌素B的最低抑菌浓度，即这两者存在协同抑菌效果。重组裂解酶裂解活性的鉴定，以及其宽裂解谱的鉴定，揭示了噬菌体ECGD1的重组裂解酶在大肠杆菌和沙门氏菌感染的防控上具有潜在的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种可以裂解大肠杆菌及沙门氏菌的噬菌体裂解酶的制备方法
本专利技术涉及动物生物医药工程
，更具体地，涉及一种可以裂解大肠杆菌及沙门氏菌的噬菌体裂解酶的制备方法。
技术介绍
大肠杆菌（Escherichiacoli）既是人和动物肠道中的一种正常栖息菌，同时也是一种重要的致病菌。大肠杆菌大致可分为肠道非致病性共生菌株、肠道致病性菌株和肠道外致病性菌株三大类。作为一种人和动物常见的致病菌，它可导致肠道感染、尿道感染、全身性感染和其它临床感染等。其中肠道外致病性菌株可引起严重的肠道外感染，尤其是尿道感染，并且在抗生素耐药性传播中扮演重要角色。在大肠杆菌多重耐药性菌株中，肠道外致病性菌株比例居多。多重耐药性问题的出现，给大肠杆菌感染的防控增添了不少难题。沙门氏菌（Salmonella）是革兰氏阴性肠道菌，是一种重要的食源性疾病的病原，已经在世界范围内造成重大的经济损失并严重威胁到公共卫生安全。由沙门氏菌感染导致的沙门氏菌病是一种食源性人畜共患病，临床症状包括肠胃炎、菌血症、伤寒症和病灶感染等；肠胃炎症状可从温和型腹部不适到呕吐脱水，甚至出现死亡。人经常因为摄入被污染的动物源食品而感染沙门氏菌，如摄入被沙门氏菌污染的鸡蛋。在全球范围内，每年由沙门氏菌感染导致的肠胃炎案例估计可达93,800,000例，死亡人数达155,000人之多，其中由食物传播引起的案例占85%左右。在大肠杆菌耐药现状中，β-内酰胺类抗生素耐药问题尤为严重。这类菌株的耐药机制主要是因为β-内酰胺酶的存在，该酶能够降解β-内酰胺类抗生素。近年来，在肠道外致病性菌株中出现了新的β-内酰胺酶，如质粒介导的AmpCβ-内酰胺酶、广谱β-内酰胺酶和碳青霉烯酶等。最出名的新型β-内酰胺酶于1983年首次被报道，并被命名为广谱β-内酰胺酶。这类酶能够降解青霉素类、头孢菌素类和单环β-内酰胺类抗生素，但不能降解头霉素和碳青霉烯类抗生素，其活性可被典型的β-内酰胺酶抑制剂所抑制。碳青霉烯抗性是最近出现的新问题，主要是由质粒编码的碳青霉烯酶所导致的，且目前碳青霉烯抗性主要出现在医院的大肠杆菌菌株，给大肠杆菌感染的防治造成不小的难题。沙门氏菌耐药性问题也日益严重，多重耐药菌株层出不穷，对红霉素、氨苄青霉素、复方新诺明、环丙沙星等的耐药性均见报道。规模化猪场的沙门氏菌耐药性问题也比较严峻，某研究者对分离自猪场粪样的沙门氏菌进行耐药性分析，发现分离菌株对四环素、环丙沙星、恩诺沙星、阿莫西林、卡那霉素、氟苯尼考和氨苄西林等表现出高度耐药。目前，多重耐药菌株的广泛流行，以及流行菌株不断产生的对喹诺酮类、第三代头孢菌素类等临床重要抗生素的耐药性，成为世界范围内新兴的棘手问题。因此，新型抗菌制剂的研发显得极为迫切。噬菌体广泛存在于环境中，是以真菌、细菌等微生物为宿主的病毒，烈性噬菌体具有高效的杀菌能力。噬菌体在侵染周期的末期合成一种噬菌体裂解酶，裂解酶破坏宿主的细胞壁，使得宿主细胞渗透压失衡并最终破裂而达到释放子代噬菌体的目的。噬菌体及其裂解酶对抗生素耐药菌同样具有杀灭作用，通过基因工程技术，可以大量地人工合成噬菌体裂解酶。因此，噬菌体及其裂解酶具有巨大的应用前景。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是寻求新的可同时抑制大肠杆菌和沙门氏菌的抗菌制剂，以期减少和替代抗生素的使用，提供表达能裂解大肠杆菌及沙门氏菌的噬菌体重组裂解酶TrxA-lysin的重组大肠杆菌BL21/pET-32a-lysin的制备方法。本专利技术的第二个目的是提供上述方法制备得到的重组裂解酶TrxA-lysin。本专利技术的第三个目的是提供所述重组裂解酶TrxA-lysin用于裂解大肠杆菌和沙门氏菌。本专利技术的目的是通过以下技术方案予以实现的：一种可以裂解大肠杆菌及沙门氏菌的噬菌体裂解酶的制备方法，包括以下步骤：S1.扩增噬菌体ECGD1的裂解酶lysin基因；与质粒相连，并转入基因工程菌获得含lysin重组质粒的基因工程菌；S2.培养所述含lysin重组质粒的基因工程菌至菌液的OD值为0.6～0.8，用IPTG诱导含lysin重组质粒的基因工程菌，获得可溶性重组蛋白TrxA-lysin；所述裂解酶lysin基因的序列如SEQIDNO：1所示。优选地，S1所述裂解酶lysin基因由引物P1和P2扩增获得，所述引物P1和P2的序列如SEQIDNO：2和SEQIDNO：3所示。pET-32a表达系统具有以下优点：属于原核表达系统，适用于噬菌体裂解酶基因的表达，自带硫氧还原蛋白TrxA基因，可增加外源蛋白的二硫键形成，增加目的蛋白的可溶性表达。作为一种具体的实施方式，本专利技术设计引物，采用PCR的方法获得可裂解大肠杆菌及沙门氏菌的噬菌体裂解酶lysin基因。将该基因连接于pET-32a表达质粒中构建重组表达质粒pET-32a-lysin，以ITPG诱导表达重组蛋白TrxA-lysin。优选地，S2所述IPTG诱导的条件为：IPTG的终浓度为1mM，诱导时间为2h，诱导温度为37℃。作为一种更优选地实施方式，本专利技术所述噬菌体裂解酶的制备方法的S1，包括以下步骤：（1）设计引物，利用PCR技术对能裂解大肠杆菌及沙门氏菌的噬菌体ECGD1的裂解酶lysin基因进行扩增。（2）将获得的lysin基因连接至pET-32a并筛选得到重组质粒pET-32a-lysin；采用热激转化法将pET-32a-lysin重组质粒导入大肠杆菌BL21中，获得重组大肠杆菌BL21/pET-32a-lysin。优选地，（1）所述PCR的反应程序为：98℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸10s，完成30循环；72℃后延伸5min。优选地，（2）所述热激转化法为：取大肠杆菌BL21感受态细胞，加入pET-32a-lysin重组质粒，混匀冰浴30min，于42℃热激转化90s后，冰浴2min，加入LB液体培养基复苏30min，平板筛选阳性转化子。优选地，本专利技术所述噬菌体裂解酶的制备方法还包括纯化可溶性重组蛋白TrxA-lysin的步骤。更优选地，所述纯化可溶性重组蛋白TrxA-lysin的步骤为：离心收集诱导表达后的BL21/pET-32a-lysin菌体细胞，洗涤，重悬后过滤，用NiNTABeads装入层析柱纯化重组蛋白TrxA-lysin。本专利技术还提供上述方法获得的噬菌体裂解酶重组蛋白TrxA-lysin。本专利技术还提供所述噬菌体裂解酶重组蛋白TrxA-lysin在裂解细菌方面的应用。本专利技术还提供所述噬菌体裂解酶重组蛋白TrxA-lysin在制备预防和/或治疗细菌感染的药物方面的应用。优选地，上述应用中，所述细菌为大肠杆菌和/或沙门氏菌。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术提供了一种表达噬菌体ECGD1裂解酶lysin基因的重组大肠杆菌的制备方法。即采用E.coliBL21/pET-32a大肠杆菌表达系统，对噬菌体ECGD1裂解酶lysin基因进行了重组表达，通过硫铁还原蛋白TrxA增加目的蛋白二硫键的形成和表达条件的优化，成功获得高活性的可溶性蛋白，蛋白纯化无需经过复杂的变性复性过程。同时，将诱导后大肠杆菌BL21/pET-32a-lysin重悬液于-80℃和室温之间冻融3次后，细菌重悬液变得澄清、粘本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可以裂解大肠杆菌及沙门氏菌的噬菌体裂解酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1. 扩增噬菌体ECGD1的裂解酶lysin基因；与质粒相连，并转入基因工程菌获得含lysin重组质粒的基因工程菌；S2. 培养所述含lysin重组质粒的基因工程菌至菌液的OD值为0.6～0.8，用IPTG诱导含lysin重组质粒的基因工程菌，获得可溶性重组蛋白TrxA‑lysin；所述裂解酶lysin基因的序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种可以裂解大肠杆菌及沙门氏菌的噬菌体裂解酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.扩增噬菌体ECGD1的裂解酶lysin基因；与质粒相连，并转入基因工程菌获得含lysin重组质粒的基因工程菌；S2.培养所述含lysin重组质粒的基因工程菌至菌液的OD值为0.6～0.8，用IPTG诱导含lysin重组质粒的基因工程菌，获得可溶性重组蛋白TrxA-lysin；所述裂解酶lysin基因的序列如SEQIDNO：1所示。2.根据权利要求1所述的噬菌体裂解酶的制备方法，其特征在于，S1所述裂解酶lysin基因由引物P1和P2扩增获得，所述引物P1和P2的序列如SEQIDNO：2和SEQIDNO：3所...

【专利技术属性】
技术研发人员：马静云，范锦戴，麦凯杰，冯嘉琪，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44