一种制备狂犬病活载体疫苗的方法及其产品和用途技术

本发明专利技术公开了一种制备狂犬病活载体疫苗的方法及其产品和用途。所述方法包括如下步骤：一、设计引物，扩增出狂犬病病毒抗原蛋白G基因与细菌鞭毛蛋白FIjB或FIiC基因；二、将抗原蛋白G基因与FIjB或FIiC基因插入到复制缺陷型腺病毒穿梭载体特异性启动子和终止子之间，构建成含有基因G-FIjB或G-FIiC的腺病毒穿梭载体；三、将获得的重组复制缺陷型腺病毒穿梭载体与腺病毒骨架载体通过同源重组得到重组腺病毒质粒；四、用重组腺病毒质粒产生基因组结构均一的重组腺病毒。此外，本发明专利技术还提出了有上述方法制备得到的狂犬病活载体疫苗。相较于现有技术，本发明专利技术制备得到的活载体疫苗更为安全和有效，且制作周期较短，在狂犬病的预防或治疗领域将具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种制备狂犬病活载体疫苗的方法及其产品和用途
本专利技术涉及利用病毒载体生产狂犬病活载体疫苗的方法及其产品和用途，特别是一种利用腺病毒载体表达狂犬病病毒G蛋白和细菌鞭毛蛋白制备狂犬病活载体疫苗的方法及其产品和用途。
技术介绍
狂犬病(rabies)是由狂犬病病毒(rabiesvirus，RV)感染引起的人兽共患急性接触性病传染病，一旦发病，则100％死亡。全球每年约有55000人死于该病，我国近5年每年死亡约3000人左右，仅次于印度，主要由犬咬伤引起。因此，预防狂犬病的主要措施是对犬、猫和野生动物进行狂犬病疫苗的免疫接种。目前我国兽用的狂犬病疫苗主要有灭活苗和弱毒苗。尽管传统疫苗在狂犬病预防控制中仍占主导地位，但由于生产成本昂贵，以及灭活不彻底而造成散毒的潜在危险等因素的存在，限制了其的广泛使用。因此，研制安全、高效的新型狂犬病分子疫苗仍显得非常必要。活载体疫苗是近年来研究的热点之一，被认为是一种很有开发前景的疫苗。制苗时往活载体中插入外源保护性目的基因，由于外源基因已经成为作为载体的病毒或细菌的自身结构的一部分，故所产生的免疫应答水平通常不低于完整病毒或细菌相应成分所引起的免疫强度。重组痘病毒载体和重组腺病毒载体具有宿主范围广，对外界有一定的抵抗力，被认为是基因工程疫苗的优良载体。虽然对重组痘病毒载体的研究起步最早，但由于痘苗病毒能在哺乳动物体内复制，人们对它的生物安全性存在某种疑问，担心与天花病毒类似的痘苗病毒在动物上应用会进化出对人类有致病性的新病毒。而复制缺陷型腺病毒常缺失对于病毒复制所必需的病毒早期基因E1区，使其在动物体内不能复制，因此研制重组复制缺陷型腺病毒狂犬病疫苗更为安全和有效。狂犬病毒有5种结构蛋白，其中糖蛋白G与病毒的感染和免疫有密切关系。研究表明G是唯一诱导中和抗体的蛋白，也能刺激细胞免疫应答，可抵抗狂犬病毒外周和脑内途径的攻击。近年来研制的狂犬病基因工程重组疫苗，大都以糖蛋白cDNA作为目的基因。这些重组疫苗虽然可以刺激特异性抗体的产生，并产生一定水平的保护力，但是，单一的糖蛋白G其总体诱导产生的抗体水平并不高，有待于提高其水平。细菌的鞭毛蛋白是鞭毛丝状部的主要成分，在细菌性病原体的毒力和细菌的运动中起着重要作用。在大多数沙门氏菌株中，有两个基因(fljB和fliC)可以编码鞭毛抗原。fliC编码一相鞭毛蛋白FliC，fljB编码二相鞭毛蛋白FljB。鞭毛蛋白也是一种病原相关分子模式(pathogen-associatedmolecularpattern，PAMP)，可以与哺乳动物细胞上的TLR5结合介导信号的传导。先天性免疫系统能够通过TLRs识别细菌上保守的PAMPs，如脂多糖和鞭毛蛋白。这些结构能够诱导强烈的炎症反应，并最终激活获得性免疫反应。活载体疫苗具有安全、高效、生产费用低廉等优点，但目前尚未有狂犬病活载体疫苗疫苗上市。综合狂犬病分子疫苗的研究现状，我们认为以腺病毒为表达载体的基因工程重组狂犬病疫苗(或称活载体疫苗)将具有良好的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用腺病毒载体表达狂犬病病毒G蛋白和细菌鞭毛蛋白制备狂犬病活载体疫苗的方法，从而获得安全、高效的狂犬病疫苗。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：本专利技术的一种利用腺病毒载体表达狂犬病病毒G蛋白和细菌鞭毛蛋白制备狂犬病活载体疫苗的方法，包括如下步骤：(1)制备目的基因：设计引物，通过PCR的方法扩增出狂犬病病毒(RabiesVirus，RV)的抗原蛋白G基因与细菌鞭毛蛋白FIjB或FIiC基因；(2)构建重组复制缺陷型腺病毒穿梭载体：将步骤(1)扩增的到的抗原蛋白G基因与细菌鞭毛蛋白FIjB或FIiC基因一同插入到复制缺陷型腺病毒穿梭载体特异性启动子和终止子之间，检测抗原蛋白G基因以及FIjB或FIiC基因是否已经整合到腺病毒穿梭载体中，构建得到含有G-FIjB或G-FIiC的重组复制缺陷型腺病毒穿梭载体，命名为PAdTrack-CMV/G-FIjB或PAdTrack-CMV/G-FIiC；(3)获得复制缺陷型腺病毒质粒：将获得的重组复制缺陷型腺病毒穿梭载体PAdTrack-CMV/G-FIjB或PAdTrack-CMV/G-FIiC与腺病毒骨架载体PAdEasy-1通过在大肠杆菌中进行质粒间同源重组从而得到重组腺病毒质粒；(4)用重组腺病毒质粒产生基因组结构均一的重组腺病毒，包括以下操作：1)用PacI酶切步骤(3)得到的重组腺病毒质粒，2)转染293细胞，3)接种293细胞，4)获得基因组结构均一的重组腺病毒，收集病毒感染的病变细胞，连同上清冻存，即得。在本专利技术中，优选的，步骤(1)中用于扩增抗原蛋白基因G和细菌鞭毛蛋白FIjB和FIiC基因的扩增引物为：GF：5’GCAGATCTGCCACCATGGTTCCTCAAGCTCTTTTG3’(含有BglⅡ酶切位点)GR：5’GCGTCGACTCACAGTCTGATCTCACC3’(含有SalⅠ酶切位点)FIjBF：5’ATTGTCGACGCCACCATGGCACAAGTAATCAACACT3’(含有SalⅠ位点)FIjBR：5’GCTCTAGATTAACGTAACAGAGACAGC3’(含有XbaⅠ酶切位点)FIiCF：5’ATTGTCGACGCCACCATGGCACAAGTCATTAATACA3’(含有SalⅠ位点)FIiCR：5’GCAAGCTTTTAACGCAGTAAAGAGAG3’(含有HindⅢ酶切位点)其中，ATG为起始密码子；狂犬病病毒G基因以狂犬病毒aG毒株为模板使用引物对GF/GR进行扩增；细菌鞭毛蛋白FIjB或FIiC基因分别以鼠伤寒沙门氏菌的鞭毛蛋白基因为模板使用引物对FIjBF/FIjBR或FIiCF/FIiCR进行扩增。在本专利技术中，优选的，在步骤(2)中，所述的腺病毒载体启动子为CMV；终止子为PolyA；所述的重组复制缺陷型腺病毒穿梭载体的构建包括以下操作：1)将扩增得到的目的基因G经BglⅡ、SalⅠ双酶切，形成带有粘性末端的目的基因片段；2)同时，将腺病毒穿梭载体PAdTrack-CMV经BglⅡ、SalⅠ双酶切，得到线性化的载体；3)使用T4DNA连接酶对上述产物进行粘端连接；4)按常规方法将连接产物转化大肠埃希氏菌，在含卡那抗性的琼脂平板上筛选，挑选克隆后，提取质粒；5)采用酶切、PCR扩增方法鉴定，得到阳性重组质粒，命名为PAdTrack-CMV/G；6)将回收得到的目的基因FIjB经SalⅠ、XbaⅠ双酶切，目的基因FIiC经SalⅠ、HindⅢ双酶切，形成带有粘性末端的目的基因片段；7)同时，将阳性重组质粒PAdTrack-CMV/G经SalⅠ、XbaⅠ双酶切或SalⅠ、HindⅢ双酶切，得到线性化的载体；8)使用T4DNA连接酶对步骤(6)和(7)的产物进行粘端连接；按常规方法将连接产物转化大肠埃希氏菌JM109，在含卡那抗性的琼脂平板上筛选，挑选克隆后，提取质粒；采用酶切、PCR扩增方法鉴定，得到阳性重组质粒，命名为PAdTrack-CMV/G-FIjB或PAdTrack-CMV/G-FIiC。在本专利技术中，优选的，在步骤(3)中，获得复制缺陷型腺病毒质粒的过程包括以下本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用腺病毒载体表达狂犬病病毒G蛋白和细菌鞭毛蛋白制备狂犬病活载体疫苗的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)制备目的基因：设计引物，通过PCR的方法扩增出狂犬病病毒(Rabies Virus，RV)的抗原蛋白G基因与细菌鞭毛蛋白FIjB或FIiC基因；(2)构建重组复制缺陷型腺病毒穿梭载体：将步骤(1)扩增的到的抗原蛋白G基因与细菌鞭毛蛋白FIjB或FIiC基因一同插入到复制缺陷型腺病毒穿梭载体特异性启动子和终止子之间，检测抗原蛋白G基因以及FIjB或FIiC基因是否已经整合到腺病毒穿梭载体中，构建得到含有G‑FIjB或G‑FIiC的重组复制缺陷型腺病毒穿梭载体，命名为PAdTrack‑CMV/G‑FIjB或PAdTrack‑CMV/G‑FIiC；(3)获得复制缺陷型腺病毒质粒：将获得的重组复制缺陷型腺病毒穿梭载体PAdTrack‑CMV/G‑FIjB或PAdTrack‑CMV/G‑FIiC与腺病毒骨架载体PAdEasy‑1通过在大肠杆菌中进行质粒间同源重组从而得到重组腺病毒质粒；(4)用重组腺病毒质粒产生基因组结构均一的重组腺病毒，包括以下操作：1)用Pac I酶切步骤(3)得到的重组腺病毒质粒，2)转染293细胞，3)接种293细胞，4)获得基因组结构均一的重组腺病毒，收集病毒感染的病变细胞，连同上清冻存，即得。...

【技术特征摘要】
1.一种利用腺病毒载体表达狂犬病病毒G蛋白和细菌鞭毛蛋白制备狂犬病活载体疫苗的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)制备目的基因：设计引物，通过PCR的方法扩增出狂犬病病毒(RabiesVirus，RV)的抗原蛋白G基因与细菌鞭毛蛋白FIjB或FIiC基因；(2)构建重组复制缺陷型腺病毒穿梭载体：将步骤(1)扩增的到的抗原蛋白G基因与细菌鞭毛蛋白FIjB或FIiC基因一同插入到复制缺陷型腺病毒穿梭载体特异性启动子和终止子之间，检测抗原蛋白G基因以及FIjB或FIiC基因是否已经整合到腺病毒穿梭载体中，构建得到含有G-FIjB或G-FIiC的重组复制缺陷型腺病毒穿梭载体，命名为PAdTrack-CMV/G-FIjB或PAdTrack-CMV/G-FIiC；(3)获得复制缺陷型腺病毒质粒：将获得的重组复制缺陷型腺病毒穿梭载体PAdTrack-CMV/G-FIjB或PAdTrack-CMV/G-FIiC与腺病毒骨架载体PAdEasy-1通过在大肠杆菌中进行质粒间同源重组从而得到重组腺病毒质粒；(4)用重组腺病毒质粒产生基因组结构均一的重组腺病毒，包括以下操作：1)用PacI酶切步骤(3)得到的重组腺病毒质粒，2)转染293细胞，3)接种293细胞，4)获得基因组结构均一的重组腺病毒，收集病毒感染的病变细胞，连同上清冻存，即得。2.根据权利要求1所述的方法，其特征是于步骤(1)中用于扩增抗原蛋白基因G和细菌鞭毛蛋白FIjB或FIiC基因的扩增引物为：GF：5’GCAGATCTGCCACCATGGTTCCTCAAGCTCTTTTG3’GR：5’GCGTCGACTCACAGTCTGATCTCACC3’FIjBF：5’ATTGTCGACGCCACCATGGCACAAGTAATCAACACT3’FIjBR：5’GCTCTAGATTAACGTAACAGAGACAGC3’FIiCF：5’ATTGTCGACGCCACCATGGCACAAGTCATTAATACA…3’FIiCR：5’GCAAGCTTTTAACGCAGTAAAGAGAG3’其中，ATG为起始密码子；狂犬病病毒G基因以狂犬病毒aG毒株为模板使用引物对GF/GR进行扩增；细菌鞭毛蛋白FIjB或FIiC基因分别以鼠伤寒沙门氏菌的鞭毛蛋白基因为模板使用引物对FIjBF/FIjBR或FIiCF/FIiCR进行扩增。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤(2)中，所述的腺病毒载体启动子为CMV；终止子为PolyA；所述的重组复制缺陷型腺病毒穿梭载体的构建包括以下操作：1)将扩增得到的目的基因G经BglⅡ、SalⅠ双酶切，形成带有粘性末端的目的基因片段；2)同时，将腺病毒穿梭载体PAdTrack-CMV经BglⅡ、SalⅠ双酶切，得到线性化的载体；3)使用T4DNA连接酶对上述产物进行粘端连接；4)按常规方法将连接产物转化大肠埃希氏菌，在含卡那抗性的琼脂平板上筛选，挑选克隆后，提取质粒；5)采用酶切、PCR扩增方法鉴定，得到阳性重组质粒，命名为PAdTrack-CMV/G；6)将回收得到的目的基因FIjB经SalⅠ、XbaⅠ双酶切，目的基因FIiC经SalⅠ、HindⅢ双酶切，形成带有粘性末端的目的基因片段；7)同时，将...

【专利技术属性】
技术研发人员：殷相平，肖星星，张韵，卫巧林，李志勇，柳纪省，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃,62