组蛋白去乙酰化酶及其抑制剂在制备肿瘤全细胞抗原负载的DC肿瘤疫苗中的应用制造技术

本发明专利技术公开了组蛋白去乙酰化酶及其抑制剂在制备肿瘤全细胞抗原负载的DC肿瘤疫苗中的应用。申请人前期研究发现，SAHA处理后的肿瘤全细胞抗原可以显著提高DC肿瘤疫苗对肿瘤的预防和治疗效果，并进一步研究了SAHA作用靶标组蛋白去乙酰化酶与肿瘤全细胞抗原负载DC肿瘤疫苗疗效的关系。结果证明，组蛋白去乙酰化酶与肿瘤全细胞抗原负载DC肿瘤疫苗疗效有关，本发明专利技术提供的组蛋白去乙酰化酶抑制剂可以通过其靶标组蛋白去乙酰化酶来增强肿瘤全细胞抗原对DC的致敏效果，从而显著提高DC肿瘤疫苗对肿瘤的预防和治疗效果。该靶标和抑制剂可以用于制备具有更高预防和治疗价值的DC肿瘤疫苗。

【技术实现步骤摘要】
组蛋白去乙酰化酶及其抑制剂在制备肿瘤全细胞抗原负载的DC肿瘤疫苗中的应用
本专利技术属于肿瘤免疫领域，涉及肿瘤疫苗，具体涉及组蛋白去乙酰化酶及其抑制剂在制备肿瘤全细胞抗原负载的DC肿瘤疫苗中的应用。
技术介绍
免疫治疗是手术、放疗、化疗之后的第四种肿瘤治疗方式，在肿瘤的综合治疗模式中，免疫治疗在提高肿瘤治愈率、改善患者生活质量、延长生存期方面起重要作用。在肿瘤免疫中，T淋巴细胞识别的肿瘤抗原不是被肿瘤细胞提呈，而是被抗原提呈细胞提呈。树突状细胞(DC)是人体内目前已知功能最强大、唯一能激活静息状态T细胞的抗原提呈细胞，具有强大的激活辅助和细胞毒T细胞的能力。树突状细胞肿瘤疫苗是肿瘤治疗的第四模式之一，有望成为一种很有实用前景的抗肿瘤方法。肿瘤全细胞抗原负载的树突状细胞肿瘤疫苗是由树突状细胞经肿瘤细胞裂解物或完整肿瘤细胞(两种最常用的全细胞抗原)致敏形成，致敏树突状细胞能表达MHC-Ⅰ、Ⅱ类分子及共刺激分子，使疫苗的抗肿瘤作用明显提高。肿瘤细胞相关抗原的表达水平对DC疫苗的治疗效果有重要影响。申请人2017年1月12日提交了名称为“一种细胞裂解液、试剂盒及在制备肿瘤全细胞抗原负载DC肿瘤疫苗中的应用”的申请，抗原结构影响DC疫苗的预防和治疗效果。申请人前期研究发现，SAHA处理后的肿瘤全细胞抗原可以显著提高DC肿瘤疫苗对肿瘤的预防和治疗效果，并进一步研究了SAHA作用靶标组蛋白去乙酰化酶与肿瘤全细胞抗原负载DC肿瘤疫苗疗效的关系。研究表明，肿瘤的发生与核小体核心组蛋白N-端的赖氨酸残基的乙酰化和去乙酰化的失衡有着密切的关系。组蛋白去乙酰化酶(HDACs)抑制剂通过调节组蛋白N-端的赖氨酸残基的乙酰化和去乙酰化，激活抑癌基因，抑制癌症基因，从而抑制肿瘤细胞生长，诱导肿瘤细胞凋亡(ApoptosisonhepatomacellsbutnotonprimaryhepatocytesbyhistonedeacetylaseinhibitorsvalproateandITF2357.JHepatol,2005,42:210-217)。康印东等2009年发表了一篇组蛋白去乙酰化酶抑制剂通过树突细胞发挥免疫调节作用的研究综述(康印东等，组蛋白去乙酰化酶抑制剂通过树突细胞发挥免疫调节作用研究，中华移植杂志2009年第3卷第2期)。该综述综合阐述了组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACI)与DC和免疫调节之间的关系。HDACI在高浓度下显示出强有力的抗肿瘤活性，在低浓度下显示出多种免疫调节作用。HDACI直接作用于DC时，降低DC在成熟的过程中向趋化因子CCL19迁移的能力，从而限制DC到达输入淋巴器官中发挥抗原呈递功能；作为最主要的抗原呈递细胞，DC对抗原特异性T淋巴细胞的活化至关重要，而HDACI影响了DC分化成熟和迁移，干扰其抗原呈递过程。总体来说，HDACI直接作用于DC起到抑制免疫应答的效果。
技术实现思路
本专利技术首先发现SAHA处理后的肿瘤全细胞抗原可以显著提高DC肿瘤疫苗对肿瘤的预防和治疗效果，然后发现SAHA是通过其靶标组蛋白去乙酰化酶来增强肿瘤全细胞抗原对DC致敏效果的，最后以组蛋白去乙酰化酶作为靶标筛选得到相关苯并噻唑类衍生物。本专利技术通过如下技术方案得以实现：组蛋白去乙酰化酶作为效应靶标在制备肿瘤全细胞抗原负载DC肿瘤疫苗中的应用。优选地，所述肿瘤全细胞抗原为肿瘤细胞裂解物抗原；所述DC肿瘤疫苗为DC与肿瘤细胞裂解物共培养致敏形成。上述组蛋白去乙酰化酶的抑制剂在制备肿瘤全细胞抗原负载DC肿瘤疫苗中的应用。一种化学试剂在制备肿瘤全细胞抗原负载DC肿瘤疫苗中的应用，包括上述组蛋白去乙酰化酶的抑制剂。优选地，所述组蛋白去乙酰化酶的抑制剂为SAHA。优选地，所述组蛋白去乙酰化酶的抑制剂为如下结构的苯并噻唑类衍生物：其中，取代基R为甲基、甲氧基、硝基、卤素或氨基中的一种。优选地，所述苯并噻唑类衍生物中的取代基R为硝基。优选地，所述苯并噻唑类衍生物中的取代基R为甲氧基。优选地，所述苯并噻唑类衍生物中的取代基R为甲基。上述DC肿瘤疫苗在预防、治疗肿瘤方面的应用。本专利技术优点：本专利技术提供的组蛋白去乙酰化酶抑制剂可以通过其靶标组蛋白去乙酰化酶来增强肿瘤全细胞抗原对DC致敏效果，从而显著提高DC肿瘤疫苗对肿瘤的预防和治疗效果。该靶标和抑制剂可以用于制备更高预防和治疗价值的DC肿瘤疫苗。本专利技术具有重要的研究意义和产业开发前景。附图说明图1为SAHA对3LL中乙酰化组蛋白H3和H4表达的影响(Hsp90为上样对照)；图2为HDACI对3LL中乙酰化组蛋白H3和H4表达的影响(Hsp90为上样对照)。具体实施方式为了更好地解释本专利技术的技术方案，下面结合具体实施例进一步介绍。实施例中未特别强调的实验材料均为常规实验材料，属于本领域技术人员易于获得的范畴。实施例1：SAHA对组蛋白去乙酰化酶活性及DC疫苗疗效的影响一、实验材料C57BL/6小鼠为8周龄雌性SPF级，购自南京大学动物中心；C57BL/6小鼠来源的肺癌细胞系3LL为本公司保存；DMEM培养基、胎牛血清购于Gibco公司。其它所用试剂均为国产或进口分析纯。二、实验方法1、小鼠骨髓DC的分离制备和鉴定脱颈处死C57BL/6小鼠，取双后腿股骨、胫骨，除去上面附着的肌肉组织，除去骨两端，暴露骨髓腔，用PBS冲洗骨髓腔数次，充分吹打制成单细胞悬液。用200目铜网过滤后，以PBS洗2次，重新悬浮细胞，配制成浓度1×l05/ml细胞悬液，放置于含15％％胎牛血清的DMEM培养液(含100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、1mM谷氨酰氨)中培养。在培养体系中加4ng/mlrhGM-CSF和10ng/mlrhIL-4，6天后培养体系中加入50ng/mlTNF-α继续培养3天使之成熟。每3天半量换液，培养至第9天时收集疏松黏附的细胞。DC表型鉴定：通过流式细胞仪测定上述方法获得的DC表达MHCⅡ类分子、CD86水平。首先将以上制备的DC分别与FICT-抗MHCⅡ类分子、CD86单抗在PBS中反应45分钟，反应结束后以PBS洗3次，上机分析。2、肺癌细胞系3LL与SAHA孵育、裂解及组蛋白去乙酰化酶活性测试实验组：C57BL/6小鼠肺癌细胞系3LL于含10％FBS的DMEM培养液中培养，选取处于对数生长期细胞，调整至1×107/mL，在培养液中加入SAHA使其浓度为0.1μM，培养6小时后，更换为不含SAHA的培养基继续培养6小时，调整至5×106/mL，加入裂解液(50mMpH7.4Tris-HCl，150mMNaCl，1％TritonX-100，0.5mMEDTA，临用前加入PMSF使终浓度为1mM)200μl，缓慢吹打约5min，收集裂解液于EP管中，4℃冰浴下于脱色摇床上振摇20min，4℃，12000×g离心15min，收集上清液，0.2μm的微孔滤膜过滤，-80℃保存。对照组除不添加SAHA外，其余同实验组。组蛋白去乙酰化酶活性测试：组蛋白去乙酰化酶(HDACs)包括多种亚型，如已知的HDAC1、HDAC2和HDAC3。已知乙酰化组蛋白H3和H4是HDAC1、HDAC2和HDAC3的底物，通过Westernblot法测定乙酰化组蛋白H3和H4的水平即可获知组蛋白去乙酰化酶活本文档来自技高网...

【技术保护点】
组蛋白去乙酰化酶作为效应靶标在制备肿瘤全细胞抗原负载DC肿瘤疫苗中的应用。

【技术特征摘要】
1.组蛋白去乙酰化酶作为效应靶标在制备肿瘤全细胞抗原负载DC肿瘤疫苗中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述肿瘤全细胞抗原为肿瘤细胞裂解物抗原；所述DC肿瘤疫苗为DC与肿瘤细胞裂解物共培养致敏形成。3.权利要求1或2所述的组蛋白去乙酰化酶的抑制剂在制备肿瘤全细胞抗原负载DC肿瘤疫苗中的应用。4.一种化学试剂在制备肿瘤全细胞抗原负载DC肿瘤疫苗中的应用，其特征在于：包括权利要求3所述的组蛋白去乙酰化酶的抑制剂。5.根据权利要求4所述的化学试剂在制备肿瘤全细胞抗原负载DC肿瘤疫苗中的应用，其特征在于：所述组蛋白去乙酰化酶的抑制剂为SAHA。6.根据权利要求4所述的化学试剂在制备肿瘤全细胞抗原...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡攀勇，张钟祥，
申请(专利权)人：南京佰泰克生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32