一种同时用两种方法互相验证型免疫传感器的制备及应用技术

本发明专利技术涉及一种同时用两种方法互相验证型免疫传感器的制备及应用，金纳米粒子功能化的硫化钴/氧化石墨烯复合物作为基底材料，甲苯胺蓝/氨基化的介孔二氧化铈/羧甲基壳聚糖/1‑丁基吡啶四氟硼酸盐作为信号标记物，检测前列腺特异性抗原夹心型免疫传感器的制备及应用，属于新型功能材料、生物传感检测技术领域。该免疫传感器是在一个传感平台通过差分脉冲伏安法和计时电流法产生不同的电化学信号建立起来的，两种平行方法的对比提高了传感器的分析性能和临床可靠性，从而对判断结果的准确性具有重要的意义。

【技术实现步骤摘要】
一种同时用两种方法互相验证型免疫传感器的制备及应用
本专利技术涉及一种基于双信号响应夹心型免疫传感器的制备及应用，属于新型功能材料与生物传感检测

技术介绍
前列腺癌是最常见的恶性肿瘤之一，在男性各种癌症中死亡率排名第二。早期检测肿瘤标记是癌症早期诊断的有效方法之一。前列腺特异性抗原(PSA)，作为一个可靠的肿瘤标志物，浓度直接与患前列腺癌的概率相关。一般来说，PSA含量在4.0~10.0ng/mL之间表明前列腺癌的概率为25%~40%，如果PSA含量大于10ng/mL患癌症的风险显著增加到67%。目前已有在临床检测前列腺特异性抗原-PSA方法有放射免疫分析、酶联免疫分析、化学发光免疫分析等。电化学免疫传感器通过把免疫学方法和电化学方法相结合的一种生物传感器，利用抗原与抗体之间的特异性结合，使得它具有高灵敏性、高选择性、分析快速和操作简便等优点。因此本专利技术制备了一种基于双信号响应夹心型免疫传感器，实现了对前列腺特异性抗原的灵敏检测。YichengWei等利用介孔二氧化铈/石墨烯复合物构建了电化学免疫传感器，介孔二氧化铈/石墨烯复合物比石墨烯具有更大的比表面积，增加了八面体钯的负载量，提高了传感器的灵敏度。该传感器的检测范围为1pg/mL~50ng/mL，检测线为0.33pg/mL。专利（201510664183.1）基于花状金铂-花状二氧化铈-氧化石墨烯构建的呕吐霉素传感器的制备方法及应用，花状二氧化铈-氧化石墨烯比石墨烯具有更大的比表面积，增加了花状金铂的负载量，提高了传感器的灵敏度。该传感器的检测范围为2pg/mL～20ng/mL，检测线为1.6pg/mL。本专利技术利用吸附在介孔二氧化铈上的甲苯胺蓝产生电化学信号。介孔二氧化铈具有丰富的孔洞结构和良好的吸附性，这些特性使介孔二氧化铈对甲苯胺蓝有一个大的吸附容量并且又有效地防止了甲苯胺蓝的泄漏。羧甲基壳聚糖掺杂1-丁基吡啶四氟硼酸盐离子液体的引入，进一步增加了介孔二氧化铈对甲苯胺蓝的吸附容量和防泄漏能力。此外，该离子液体还具有促进电子转移和增加传感器的稳定性和灵敏度的作用。硫化钴/氧化石墨烯复合物具有大的比表面积，高效的催化性，用金纳米粒子功能化后，利用金与氨基的成键作用去固定捕获抗体，增加了免疫传感器的稳定性和灵敏度。进行差分脉冲伏安法测试时，金纳米粒子功能化的硫化钴/氧化石墨烯复合物不产生电化学信号，但是其良好的导电性增加了传感器的灵敏度。进行计时电流法测试时，介孔二氧化铈没有催化双氧水的作用，但是其空间位阻降低了金纳米粒子功能化的硫化钴/氧化石墨烯复合物催化双氧水产生的信号，增加传感器的灵敏度。该免疫传感器是在一个传感平台通过差分脉冲伏安法和计时电流法产生不同的电化学信号建立起来的，两种平行测定方法的结合提高了传感器的分析性能和临床可靠性。该方法成本低、灵敏度高、特异性好、检测快速，而且制备过程简单，为目前有效检测前列腺特异性抗原提供了新途径。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是以金纳米粒子功能化的硫化钴/氧化石墨烯复合物为基底材料，以甲苯胺蓝/氨基化的介孔二氧化铈/羧甲基壳聚糖/1-丁基吡啶四氟硼酸盐为信号标记物构建了一种双响应、无酶、快速且超灵敏的夹心型电化学免疫传感器。本专利技术的目的之二是利用金纳米粒子功能化的硫化钴/氧化石墨烯复合物基底和甲苯胺蓝/氨基化的介孔二氧化铈/羧甲基壳聚糖/1-丁基吡啶四氟硼酸盐信号标记物之间的相互作用增加了免疫传感器的稳定性和灵敏度。本专利技术的目的之三是在一个传感平台上，分别用差分脉冲伏安法和计时电流法实现了对前列腺特异性抗原的检测，通过两种平行方法的对比提高了传感器的分析结果的准确性和临床可靠性。本专利技术的技术方案如下：(1)金纳米粒子的制备将100mL，质量分数0.01%HAuCl4溶液加热至沸腾，接着将1.5mL，质量分数1%)柠檬酸三钠溶液加入并保持30分钟，在大约1分钟后沸腾溶液变成了酒红色，冷却至室温备用。(2)硫化钴/氧化石墨烯复合物的制备首先，将0.4mmol乙酸钴和1.6mmolL-半胱氨酸溶解在60mL蒸馏水，搅拌30分钟；接着，再加入100mg的氧化石墨烯，搅拌30min后，转移到高压反应釜中，在200ºC条件下，反应10h，反应结束冷却至室温，用去离子水洗涤3次，转速为8000rpm，离心5min，在50ºC真空干燥箱中干燥12h，得到的黑色粉末为硫化钴/氧化石墨烯复合物。(3)金纳米粒子功能化的硫化钴/氧化石墨烯复合物的制备取上述产物50mg硫化钴/氧化石墨烯复合物放入锥形瓶中，加入60mL上述金纳米粒子悬浮液，超声30min，震荡12h，复合结束后，用去离子水洗涤3次，最后用无水乙醇洗一次，转速为8000rpm，离心5min，在50ºC真空干燥箱中干燥12h，得到黑色粉末金纳米粒子功能化的硫化钴/氧化石墨烯复合物。(4)氨基化的纳米介孔二氧化铈的制备将1mL高纯水，1.0g硝酸铈置于锥形瓶中，在搅拌下加入1mL丙酸和30mL的乙二醇，搅拌30min后，转移到高压反应釜中，在180ºC条件下，反应200min，反应结束冷却至室温，用去离子水洗涤3次，转速为8000rpm，离心5min，在50ºC真空干燥箱中干燥12h，得到粉末为纳米介孔二氧化铈；接着，取上述产物纳米介孔二氧化铈0.1g放入三口烧瓶中，加入20mL无水乙醇，超声30min，接着加入0.2mL的3-氨丙基-三乙氧基硅烷，置于油浴锅中，在70ºC条件下，回流1.5h，待反应结束后，冷却至室温，用去离子水洗涤3次，最后用无水乙醇洗一次，转速为8000rpm，离心5min，在50ºC真空干燥箱中干燥12h，得到黑色粉末为氨基化的纳米介孔二氧化铈。(5)甲苯胺蓝/氨基化的介孔二氧化铈/羧甲基壳聚糖/1-丁基吡啶四氟硼酸盐离子液体标记矩阵的前列腺特异性抗原检测抗体溶液的制备将1.5mg的氨基化的纳米介孔二氧化铈、10mmol的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、2mmol的N-羟基琥珀酰亚胺和1mL的浓度为10μg/mL前列腺特异性抗原检测抗体混合，在4ºC震荡12h，离心洗涤；然后，将1mL、2mg/mL的甲苯胺蓝加入在沉淀物中，在4ºC震荡12h，离心洗涤；最后，1mL质量分数为1%羧甲基壳聚糖和浓度为0.8mg/mL1-丁基吡啶四氟硼酸盐离子液体加入在沉淀物中，在4ºC震荡2h，离心后，得到的甲苯胺蓝/氨基化的介孔二氧化铈/羧甲基壳聚糖/1-丁基吡啶四氟硼酸盐离子液体标记矩阵的前列腺特异性抗原检测抗体孵化物重新分散于1mL、pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，于4ºC冰箱中储存备用。本专利技术的有益成果（1）本专利技术首次在一个传感平台通过差分脉冲伏安法和计时电流法产生不同的电化学信号建立起来的。（2）本专利技术首次将金纳米粒子功能化的硫化钴/氧化石墨烯复合物引入电化学免疫传感器作为基底材料，利用其对双氧水具有高效的催化性和良好的导电性。（3）本专利技术利用介孔二氧化铈大比表面积和良好的吸附性能，吸附甲苯胺蓝直接产生电化学信号。将羧甲基壳聚糖掺杂1-丁基吡啶四氟硼酸盐的离子液体引入，与介孔二氧化铈共同增加了甲苯胺蓝的吸附容量并有效地防止其泄漏，此外具有促进电子转移的作用。（4）本专利技术利用金纳米粒子功能化的硫化钴/氧化石墨烯复合本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同时用两种方法互相验证型免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)依次用1.0、0.3、0.05 µm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，用超纯水清洗干净，然后将电极置于5 mmol/L铁氰化钾溶液中，在‑0.2~0.6 V电位下扫描，使峰电位差小于110 mV；(2)用6 μL浓度为0.3 ~ 1.6 mg/mL金纳米粒子功能化的硫化钴/氧化石墨烯复合物溶液滴加到电极表面，室温下晾干；(3)继续将6 µL浓度为8 ~ 12 µg/mL的前列腺特异性抗原捕获抗体溶液滴加到修饰电极表面，4 ºC下晾干，超纯水冲洗；(4)用6 μL质量分数为0.05 ~ 0.15%的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，4 ºC下晾干，超纯水冲洗；(5)将6 μL浓度为0.0005 ~ 50 ng/mL的一系列不同浓度的前列腺特异性抗原滴加到修饰电极表面，4 ºC下晾干，超纯水冲洗；(6)将6 μL浓度为0.3~ 1.5 mg/mL的甲苯胺蓝/氨基化的介孔二氧化铈/羧甲基壳聚糖/1‑丁基吡啶四氟硼酸盐离子液体标记矩阵的前列腺特异性抗原检测抗体溶液滴在电极上，室温下孵化1 h，清洗后，晾干，冰箱中储存备用。...

【技术特征摘要】
1.一种同时用两种方法互相验证型免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)依次用1.0、0.3、0.05µm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，用超纯水清洗干净，然后将电极置于5mmol/L铁氰化钾溶液中，在-0.2~0.6V电位下扫描，使峰电位差小于110mV；(2)用6μL浓度为0.3~1.6mg/mL金纳米粒子功能化的硫化钴/氧化石墨烯复合物溶液滴加到电极表面，室温下晾干；(3)继续将6µL浓度为8~12µg/mL的前列腺特异性抗原捕获抗体溶液滴加到修饰电极表面，4ºC下晾干，超纯水冲洗；(4)用6μL质量分数为0.05~0.15%的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，4ºC下晾干，超纯水冲洗；(5)将6μL浓度为0.0005~50ng/mL的一系列不同浓度的前列腺特异性抗原滴加到修饰电极表面，4ºC下晾干，超纯水冲洗；(6)将6μL浓度为0.3~1.5mg/mL的甲苯胺蓝/氨基化的介孔二氧化铈/羧甲基壳聚糖/1-丁基吡啶四氟硼酸盐离子液体标记矩阵的前列腺特异性抗原检测抗体溶液滴在电极上，室温下孵化1h，清洗后，晾干，冰箱中储存备用。2.如权利要求1所述的一种同时用两种方法互相验证型免疫传感器的制备方法，所述金纳米粒子功能化的硫化钴/氧化石墨烯复合物的制备，其特征在于，包括以下步骤：(1)金纳米粒子的制备将100mL，质量分数0.01%HAuCl4溶液加热至沸腾，接着将1.5mL，质量分数1%柠檬酸三钠溶液加入并保持30分钟，在大约1分钟后沸腾溶液变成了酒红色，冷却至室温备用；(2)硫化钴/氧化石墨烯复合物的制备首先，将0.4mmol乙酸钴和1.6mmolL-半胱氨酸溶解在60mL蒸馏水，搅拌30分钟；接着，再加入50~100mg的氧化石墨烯，搅拌30min后，转移到高压反应釜中，在200ºC条件下，反应10h，反应结束冷却至室温，用去离子水洗涤3次，转速为8000rpm，离心5min，在50ºC真空干燥箱中干燥12h，得到的黑色粉末为硫化钴/氧化石墨烯复合物；(3)金纳米粒子功能化的硫化钴/氧化石墨烯复合物的制备取上述产物30~50mg硫化钴/氧化石墨烯复合物放入锥形瓶中，加入50~70mL上述金纳米粒子悬浮液，超声30min，震荡12h，复合结束后，用去离子水洗涤3次，最后用无水乙醇洗一次，转速为8000rpm，离心5min，在50ºC真空干燥箱中干燥12h，得到黑色粉末金纳米粒子功能化的硫化钴/氧化石墨烯复合物。3.如权利要求1所述的一种同时用两种方法互相验证型免疫传感器的制备方法，所述甲苯胺蓝/氨基化的介孔二氧化铈/羧甲基壳聚糖/1-丁基吡啶...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏贻成，魏琴，吴丹，张勇，王欢，王雪莹，范大伟，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东,37