基于核酸适配体检测汞离子的电化学传感器及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种基于核酸适配体构象变化检测汞离子的电化学传感器，其包括电极，所述电极上依次修饰有HAP层和Helper层，同时提供了其基于核酸适配体的特异性识别的生物学制备方法，本发明专利技术提供的电化学传感器，检测用具有特异性和灵敏度高、成本低、检测速度快的特点。

【技术实现步骤摘要】
基于核酸适配体检测汞离子的电化学传感器及其制备方法
本专利技术涉及生物传感器
，特别涉及基于核酸适配体构象变化的汞离子的电化学传感器，还涉及其制备方法。
技术介绍
汞及其化合物对人体健康存在多种伤害，若存在于天然水体中，则会对大范围的人群造成威胁。它能够在生物体内积累，通过食物链转移到人体内。人体内累积的微量汞无法通过自身代谢进行排泄，将直接导致心脏、肝甲状腺疾病，引起神经系统紊乱，慢性汞中毒，甚至引发恶性肿瘤的形成。溶解态的Hg²+往往具有较高的化学活性，是排入天然水体中汞污染物的主要存在形式，其化合物具有较高的水溶性，也是各种汞形态转化的枢纽。因此，汞离子的分析测定是人们十分关注的课题。目前，常用的汞化合物检测方法包括分光光度法、原子发射光谱法、原子吸收光谱法、氢化物发生-原子荧光光谱法等，这些方法往往存在仪器昂贵、分析周期长、样品预处理复杂、检测费用昂贵等问题，已经难以适应汞离子检测的方便、快捷、灵敏度等方面的要求。因此，目前急需建立一种快速，准确，灵敏且高特异性的检测方法来检测食品中汞离子的残留。
技术实现思路
为了解决以上现有技术中检测汞离子的方法特异性和灵敏度都比较低、成本高的问题，本专利技术提供了一种特异性和灵敏度高、成本低、检测速度快的基于核酸适配体构象变化检测汞离子的电化学传感器。本专利技术还提供了基于核酸适配体构象变化检测汞离子的电化学传感器的制备方法。本专利技术是通过以下步骤得到的：本专利技术中一共用到了3条DNA链，其序列分别是：HAP:5’-CCCAACTTTCCTCAGCTTGGGTAGGGCGGGTTGGGTTTTTT-SH-3’(SEQIDNO:1)；Helper1:5’-CCTACCCTTTGTTCTTTG-3’(SEQIDNO:2)；Helper2:5’-CTTTGTTCTTTGCTGAGG-3’(SEQIDNO:3)。其中Helper1与Helper2中画横线部分的T之间可特异性结合汞离子，从而形成“T-Hg²+-T”结构。HAP的3’端修饰有巯基（-SH），可以与金电极形成稳定的Au-S键，从而将HAP固定在电极表面；序列中有富含鸟嘌呤G的DNA序列即血红素hemin的适配体，它在被暴露的情况下可以和hemin特异性的形成G-四联体结构，在钾离子和双氧水的存在下，发生氧化还原反应，我们就是通过检测该氧化还原信号来达到定量的检测目标物的目的。本专利技术中只用到了一种酶：核酸限制性内切酶Nt.BbvCI，可以识别特定的双链序列。本专利技术中汞离子的检测是在电极上实现的，通过目标循环的方式来实现信号的增大，从而实现汞离子的高灵敏检测，并获得较低的检测下限。均相中发生的反应主要有：在有目标物存在的情况下，Helpe1与Helper2中T之间会由目标物连接形成“T-Hg2+-T”结构，而Helper1与Helper2未结合的部分会与固定在电极表面的HAP的环部通过碱基互补配对进行结合，形成Y型结构，在限制性内切酶Nt.BbvCI的作用下，HAP被切割，暴露出hemin的适配体序列，并释放目标物Hg2+同Helper1及Helper2结合在一起的复合物部分同未参与反应的HAP形成新的Y型结构，实现目标循环放大信号。加入hemin后，暴露出来的适配体形成G-四联体，在K+和双氧水存在的情况下，产生氧化还原信号。在均相反应中，放大的反应条件均为37℃，反应时间是2h。一种基于核酸适配体检测汞离子的生物传感器，在电极上依次修饰有HAP层和Helper层；HAP层中HAP为5’-CCCAACTTTCCTCAGCTTGGGTAGGGCGGGTTGGGTTTTTT-SH-3’Helper层中含有Helper1、Helper2、Hg2+、Nt.BbvCI、Helper1:5’-CCTACCCTTTGTTCTTTG-3’，Helper2:5’-CTTTGTTCTTTGCTGAGG-3’；所述的生物传感器，HAP层的厚度为15±2nm、Helper层的厚度约为10±2nm。所述的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：（1）对电极进行预处理；（2）将HAP层修饰到电极表面；（3）将Helper层修饰到电极表面。所述的制备方法，优选将HAP层修饰到电极表面的操作步骤如下：将10μM的HAP滴加10μL到经过预处理的电极表面，在37℃下孵育2h。所述的制备方法，优选将Helper层修饰到电极表面的操作步骤如下：（1）将灭菌水，1X的buffer缓冲液、Helper1、Helper2、核酸限制性内切酶Nt.BbvCI和待测目标物加入离心管中，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育2h；（2）将孵育好的混合溶液滴加到修饰好HAP层的电极上，将电极继续放在37℃的恒温箱中孵育2h，清洗。所述的制备方法，优选对电极进行预处理操作为电极在0.3和0.05µm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用PBS和二次水冲洗。所述的制备方法，优选所述电极为金电极。该专利技术的检测方式是电化学检测，利用传统的三电极体系。Ag/AgCl为参比电极，铂丝为对电极，修饰的金电极为工作电极。在检测之前，先通过Au-S键将HAP固定到电极表面。将反应后的均相溶液修饰到电极表面，然后37℃孵育2h使均相中的Helper1及Helper2未结合部分与电极表面的HAP完成杂交反应，并由核酸限制性内切酶Nt.BbvCI完成对其的切割。暴露出的hemin适配体在加入hemin后形成G-四联体，在K+和双氧水存在的情况下产生氧化还原信号，用三电极工作体系检测氧化还原峰。以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为0到-0.5V，脉冲宽度0.05V，扫描速率为0.06S，采用差分脉冲伏安技术读取氧化还原信号的变化，检测待测目标物。本专利技术基于核酸适配体特异性识别hemin形成G-四联体结构，目标物与核酸形成“T-Hg2+-T”结构，核酸限制性内切酶在特异性位点对核酸双链的切割作用以及G-四联体氧化还原特性构建了适配体电化学生物传感器。该传感器具有检测速度快，检测限低，特异性高等优点，可以弥补汞离子现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速，准确的定量检测。本专利技术的有益效果：1、利用了核酸适配体的特异型识别，利用汞离子的适体作为识别物质实现了对目标物汞离子的高特异性检测；2、利用核酸限制性内切酶的切割作用，实现了目标物的循环利用，起到了信号增大的作用；3、利用核酸适配体的特异性识别，在加入hemin后形成G-四联体结构，在K+和双氧水存在的情况下产生氧化还原信号；4、该传感器的反应条件温和，反应速度快；5、由于使用金电极，其电极简便、小型化、易携带、可多次使用；6、检测原理的主要过程均是在电极上实现的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测；7、制备方法简单，性能稳定，电极的重复性好，适用于食品安全中汞离子的检测和生物传感器产业化的实际应用；8、制作电极的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求。附图说明图1为电化学传感器的检测原理图；图2为实施例1Helper1优化检测结果图；图3为实施例2Helper2优化检测结果图；图4为实施例3HAP优化检测结果图；图5为实施例4目标物工作曲线。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于核酸适配体检测汞离子的电化学传感器，其特征在于，其包括电极，所述电极上依次修饰有HAP层和Helper层。

【技术特征摘要】
1.一种基于核酸适配体检测汞离子的电化学传感器，其特征在于，其包括电极，所述电极上依次修饰有HAP层和Helper层。2.根据权利要求1所述的电化学传感器，HAP层的厚度为15±2nm、Helper层的厚度为10±2nm。3.一种权利要求1或2所述的生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）对电极进行预处理；（2）将HAP修饰到电极表面形成HAP层；（3）将Helper1和Helper2修饰到电极表面形成Helper层；所述HAP的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；所述Helper1的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示；所述Helper2的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）具体操作步骤如下：将10μM...

【专利技术属性】
技术研发人员：李慧，韩聪，刘素，王玉，黄加栋，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东,37