检测伪狂犬病病毒野毒株的交叉引物扩增‑免疫层析试纸联用法的引物和探针组以及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种检测伪狂犬病病毒野毒株的交叉引物扩增‑免疫层析试纸联用法的引物和探针组以及试剂盒。本发明专利技术首先公开用于检测伪狂犬病病毒野毒株的交叉引物扩增‑免疫层析试纸联用法的引物和探针组，包括两条外侧引物、一条交叉引物和两条探针。本发明专利技术进一步公开检测伪狂犬病病毒野毒株的交叉引物扩增‑免疫层析试纸联用试剂盒，包括交叉引物扩增试剂和免疫层析试纸条。本发明专利技术以病毒基因组DNA为模板，利用交叉引物扩增试剂建立CPA反应体系并进行扩增，扩增产物上样免疫层析试纸条进行结果判定。本发明专利技术所述引物和探针组及试剂盒能特异性检测伪狂犬病病毒野毒株，敏感性和特异性好，可视化程度高，操作简便，适于伪狂犬病病毒的现地检测。

【技术实现步骤摘要】
检测伪狂犬病病毒野毒株的交叉引物扩增-免疫层析试纸联用法的引物和探针组以及试剂盒
本专利技术涉及伪狂犬病病毒野毒株的检测，尤其涉及检测伪狂犬病病毒野毒株的交叉引物扩增-试纸条联用法的引物和探针组以及试剂盒，属于伪狂犬病病毒野毒株的检测领域。
技术介绍
伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)引起的可感染猪和其它多种动物的急性传染病。该病可导致仔猪死亡、架子猪呼吸道疾病、母猪流产等(Mettenleiter,T.C.,1996.Immunobiologyofpseudorabies(Aujeszky’sdisease).Vet.Immunol.Immunopathol.54,221–229.)。PRV也称奥耶茨基氏病毒或猪疱疹病毒1型，属疱疹病毒科，基因组全长143kb(Nauwynck,H.,Glorieux,S.,Favoreel.H.,Pensaert,M.,2007.Cellbiologicalandmolecularcharacteristicsofpseudorabiesvirusinfectionsincellculturesandinpigswithemphasisontherespiratorytract.Vet.Res.38,229–241；Mettenleiter,T.C.,2000.Aujeszky’sdisease(Pseudorabies)virus:thevirusandmolecularpathogenesis–stateoftheart.Vet.Res.31,99–115.)。Bartha-K61是一种gE/gI基因缺失的PRV疫苗，可为猪只抵抗PRV提供保护。从2011年底开始，中国多个省份的养猪场陆续爆发伪狂犬病，即使免疫过Bartha-K61弱毒疫苗，仍然无法有效抵御新的疫情。研究证实，此次疫情由PRV变异株引起，同时，目前的Bartha-K61疫苗株已不能有效抵抗PRV变异株(An,T.Q.,Peng,J.M.,Tian,Z.J.,Zhao,H.Y.,Li,N.,Liu,Y.M.,Chen,J.Z.,Leng,C.L.,Sun,Y.,Chang,D.,Tong,G.Z.,2013.PseudorabiesvirusvariantinBartha-K61-vaccinatedpigs,China,2012.Emerg.Infect.Dis.19,1749–1755.)，因此该病毒的诊断检测成为控制该疫情的主要手段。PRV经典的检测方法为免疫荧光试验(Stewart,W.C.,Carbrey,E.A.,Kresse,J.I.,1967.Detectionofpseudorabiesvirusbyimmunofluorescence.J.Am.Vet.Med.Assoc.151,747–751；Ducatelle,R.,Coussement,W.,Hoorens,J.,1982.ImmunoperoxidasestudyofAujeszky’sdiseasevirusinpigs.Res.Vet.Sci.32,294–302.)和病毒分离(Pensaert,M.B.,Kluge,J.P.,1989.Pseudorabiesvirus(Aujeszky’sdisease).In:PensaertMB(ed)VirusInfectionsofPorcines.ElsevierPress,Amsterdam,pp39–65.)，但是这两种方法实验周期过长。目前，已建立多种PRV常用检测方法，如聚合酶链扩增反应(PCR)、荧光定量PCR、免疫层析试纸以及基于胶体金的电化学反应。但是，血清学分析方法难以检测PRV感染早期的阳性样本，而分子诊断分析方法通常需要复杂的特殊仪器。因此，需要建立一种快速、稳定、无需复杂仪器并能进行现地检测的诊断方法用以监控此次疫情。交叉引物扩增(CPA)技术是近几年开发出的一种新的诊断检测方法(Xu,G.,Hu,L.,Zhong,H.,Wang,H.,Yu,S.,Weiss,T.C.,Romaniuk,P.L.,You,Q.,2012.CrossPrimingAmplification:MechanismandOptimizationforIsothermalDNAAmplification.Sci.Rep.2,246–252.)。该方法的扩增体系由四到五个普通引物和一个交叉引物组成，在恒温条件下，生成长短不一的发卡型的扩增产物。CPA扩增产物能够与特异结合DNA双链的荧光染料结合，发出荧光，根据荧光强度进行判定，但是荧光信号难以被裸眼准确识别。因此，建立一种交叉引物扩增-免疫层析试纸联用法(CPA-strip)用于检测PRV野毒，结合CPA高效的DNA扩增能力和试纸条可视化特点，对于有效控制PR疫情将具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术所要解决的第一个技术问题是提供用于检测伪狂犬病病毒野毒株的交叉引物扩增-免疫层析试纸联用法的引物和探针组；本专利技术所要解决的第二个技术问题是提供一种检测伪狂犬病病毒野毒株的交叉引物扩增-免疫层析试纸联用试剂盒，并建立一种检测伪狂犬病病毒野毒株的交叉引物扩增-免疫层析试纸联用法。为解决上述技术问题，本专利技术所采取的技术方案是：本专利技术首先公开了用于检测伪狂犬病病毒野毒株的交叉引物扩增-免疫层析试纸联用法的引物和探针组，包括两条外侧引物、一条交叉引物和两条探针；其中，所述外侧引物1的核苷酸序列为SEQIDNo.1所示，所述外侧引物2的核苷酸序列为SEQIDNo.2所示；所述交叉引物的核苷酸序列为SEQIDNo.3所示；所述探针1的核苷酸序列为SEQIDNo.4所示，所述探针2的核苷酸序列为SEQIDNo.5所示(即方案3)；或者，所述外侧引物1的核苷酸序列为SEQIDNo.6所示，所述外侧引物2的核苷酸序列为SEQIDNo.7所示；所述交叉引物的核苷酸序列为SEQIDNo.8所示；所述探针1的核苷酸序列为SEQIDNo.9所示，所述探针2的核苷酸序列为SEQIDNo.10所示(即方案1)；或者，所述外侧引物1的核苷酸序列为SEQIDNo.11所示，所述外侧引物2的核苷酸序列为SEQIDNo.12所示；所述交叉引物的核苷酸序列为SEQIDNo.13所示；所述探针1的核苷酸序列为SEQIDNo.14所示，所述探针2的核苷酸序列为SEQIDNo.15所示(即方案2)。大多数的伪狂犬病(PR)疫苗为gE/gI缺失疫苗，如Bartha-K61、SA215和HB98。本专利技术分析了PRV不同毒株基因序列，策略性地在Bartha-K61疫苗株缺失的gI/gE基因的保守区域设计多组引物及探针，分别包括两条外侧引物、两条探针和一条交叉引物。探针和引物的筛选结果表明，本专利技术所设计的方案1和方案2在检测阴性样品时，可能会与猪基因组DNA产生交叉反应，产生假阳性，不能准确检测PRV；而方案3在检测阴性样品时无条带生成，与猪基因组DNA无交叉反应，同时在检测阳性样品时有明显条带生成。本专利技术将方案3中探针和引物与NCBI中已知的PRV毒株序列进行比对，结果显示探针和引物能正确识别已知序列。本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测伪狂犬病病毒野毒株的交叉引物扩增‑免疫层析试纸联用法的引物和探针组，包括两条外侧引物、一条交叉引物和两条探针；其特征在于，选自以下三组引物和探针中的任意一组：(1)所述外侧引物1的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，所述外侧引物2的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示；所述交叉引物的核苷酸序列为SEQ ID No.3所示；所述探针1的核苷酸序列为SEQ ID No.4所示，所述探针2的核苷酸序列为SEQ ID No.5所示；(2)所述外侧引物1的核苷酸序列为SEQ ID No.6所示，所述外侧引物2的核苷酸序列为SEQ ID No.7所示；所述交叉引物的核苷酸序列为SEQ ID No.8所示；所述探针1的核苷酸序列为SEQ ID No.9所示，所述探针2的核苷酸序列为SEQ ID No.10所示；(3)所述外侧引物1的核苷酸序列为SEQ ID No.11所示，所述外侧引物2的核苷酸序列为SEQ ID No.12所示；所述交叉引物的核苷酸序列为SEQ ID No.13所示；所述探针1的核苷酸序列为SEQ ID No.14所示，所述探针2的核苷酸序列为SEQ ID No.15所示。...

【技术特征摘要】
1.用于检测伪狂犬病病毒野毒株的交叉引物扩增-免疫层析试纸联用法的引物和探针组，包括两条外侧引物、一条交叉引物和两条探针；其特征在于，选自以下三组引物和探针中的任意一组：(1)所述外侧引物1的核苷酸序列为SEQIDNo.1所示，所述外侧引物2的核苷酸序列为SEQIDNo.2所示；所述交叉引物的核苷酸序列为SEQIDNo.3所示；所述探针1的核苷酸序列为SEQIDNo.4所示，所述探针2的核苷酸序列为SEQIDNo.5所示；(2)所述外侧引物1的核苷酸序列为SEQIDNo.6所示，所述外侧引物2的核苷酸序列为SEQIDNo.7所示；所述交叉引物的核苷酸序列为SEQIDNo.8所示；所述探针1的核苷酸序列为SEQIDNo.9所示，所述探针2的核苷酸序列为SEQIDNo.10所示；(3)所述外侧引物1的核苷酸序列为SEQIDNo.11所示，所述外侧引物2的核苷酸序列为SEQIDNo.12所示；所述交叉引物的核苷酸序列为SEQIDNo.13所示；所述探针1的核苷酸序列为SEQIDNo.14所示，所述探针2的核苷酸序列为SEQIDNo.15所示。2.权利要求1所述的引物和探针组在检测伪狂犬病病毒野毒株中的应用。3.一种检测伪狂犬病病毒野毒株的交叉引物扩增-免疫层析试纸联用试剂盒，包括：交叉引物扩增试剂和免疫层析试纸条；其中，所述交叉引物扩增试剂包括：外侧引物1、外侧引物2、交叉引物、探针1、探针2、dNTP、Mg2+、10×ThermoPol缓冲液、BstDNA聚合酶和扩增增强剂；其特征在于：所述外侧引物1、外侧引物2、交叉引物、探针1和探针2选自权利要求1所述的引物和探针组；所述探针1的5′-端连接有FITC，所述探针2的5′-端连接有生物素。4.按照权利要求3所述的交叉引物扩增-免疫层析试纸联用试剂盒，其特征在于：所述外侧引物1的核苷酸序列为SEQIDNo.1所示，所述外侧引物2的核苷酸序列为SEQIDNo.2所示；所述交叉引物的核苷酸序列为SEQIDNo.3所示；所述探针1的核苷酸序列为SEQIDNo.4所示，所述探针2的核苷酸序列为SEQIDNo.5所示。5.按照权利要求3所述的交叉引物扩增-免疫层析试纸联用试剂盒，其特征在于：所述扩增增强剂选自甜菜碱或二甲基亚砜，优选为甜菜碱。6.按照权利要求3所述的交叉引物扩增-免疫层析试纸联用试剂盒，其特征在于，利用所述交叉引物扩增试剂建立的CPA反应体系包括：反应体系的总体积为25.0μL；其中，10μM交叉引物2.0μL...

【专利技术属性】
技术研发人员：仇华吉，孟星宇，高瑶，张华伟，罗玉子，孙元，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23