一种检测环境气溶胶样本中多杀性巴氏杆菌的试剂盒及用途制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测环境气溶胶样本中多杀性巴氏杆菌的引物和探针组合，其特征在于，包括正向引物、反向引物和探针；其正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列如SEQ ID NO.2所示，探针序列如SEQ ID NO.3所示。本发明专利技术还公开了用于检测气溶胶样本多杀性巴氏杆菌的试剂盒。本发明专利技术利用TaqMan实时荧光定量PCR检测气溶胶样本中多杀性巴氏杆菌的含量及其分布情况，预报巴氏杆菌病发生的风险，为场区卫生消毒试剂的选择、使用次数及重点消毒区域的确定提供参考。

【技术实现步骤摘要】
一种检测环境气溶胶样本中多杀性巴氏杆菌的试剂盒及用途
本专利技术涉及微生物检测
，具体涉及一种检测环境气溶胶样本中多杀性巴氏杆菌的试剂盒及用途。
技术介绍
多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamutocida，Pm)是引起多种畜禽巴氏杆菌病的革兰氏阴性病原菌，一般寄生于动物的上呼吸道，具有条件致病性，在某些应激条件刺激下，可引起带菌动物发生出血性败血病或呼吸系统疾病。家畜中以牛、猪、兔、绵羊发病较多，山羊、鹿、骆驼、马、驴、犬、猫和水貂等亦可感染发病。禽类中以鸡、火鸡和鸭最易感，鹅、鸽次之。根据荚膜抗原的特异性，可将Pm分为5个血清型(A、B、D、E、F)。在我国，引起禽和猪巴氏杆菌病的主要病原是荚膜血清A型Pm，引起牛的主要为荚膜A型和B型Pm，荚膜A型主要表现为牛纤维素性化脓性肺炎，荚膜B型主要表现为牛出血性败血症。由于Pm可以在同种或不同种动物间互相传染，对养殖业危害严重。多杀性巴氏杆菌病主要通过呼吸道和消化道传播，在养殖场环境中病畜、病禽的排泄物、分泌物及带菌动物将多杀性巴氏杆菌排向环境，细菌漂浮在空气中，形成病原气溶胶，健康动物经呼吸道吸入多杀性巴氏杆菌气溶胶后即可感染。由于巴氏杆菌病原血清型复杂，各型之间没有交叉保护性，疫苗防控本病难度较大，通过定期监测，结合卫生消毒及生物安全等可有效预防本病的发生。多杀性巴氏杆菌病的病原学诊断方法主要有细菌的分离培养、生化鉴定、动物回归试验等，但这些方法费时、操作繁琐、准确率低，不适合临床快速诊断和监测的需要，很难做到早期预警和隐性感染牛的筛查。以环境气溶胶样本为监测对象，应用灵敏、特异和快速的Real-TimePCR方法可以有效地进行群体监测，并对牛场卫生消毒和生物安全效果进行评估。但由于多杀性巴氏杆菌气溶胶中细菌的含量很低，对检测方法的灵敏度要求很高，再加之气溶胶样本的采集相对较困难，因此，目前还未有针对多杀性巴氏杆菌气溶胶采用TaqMan技术进行检测的相关报道。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一种检测环境气溶胶样本中多杀性巴氏杆菌的试剂盒及用途。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：第一方面，本专利技术提供一种用于检测环境气溶胶样本中多杀性巴氏杆菌的引物和探针组合，包括正向引物、反向引物和探针；其正向引物序列如SEQIDNO.1所示，反向引物序列如SEQIDNO.2所示，探针序列如SEQIDNO.3所示。具体序列如下：正向引物：5′-TTGGTGTGTTGAGCCAATCTG-3′；(SEQIDNO.1)反向引物：5′-GACAAGGAAATATAAACCGGCAAA-3′；(SEQIDNO.2)探针：5′-(Cy5)TCCTTGACAACGGCGCAACTGATTG(BHQ-2)-3′(SEQIDNO.3)。第二方面，本专利技术提供一种用于检测环境气溶胶样本中多杀性巴氏杆菌的试剂盒，该试剂盒中包含上述的引物和探针组合。进一步的，该试剂盒中还包括：阳性标准质粒、阴性对照和实时荧光定量PCR(qPCR)试剂。所述阳性标准质粒由含有如SEQIDNo.4所示(241个碱基)的核苷酸片段构成的pEASY-T3重组质粒组成；具体如下：5'-TTGGTGTGTTGAGCCAATCTGCTTCCTTGACAACGGCGCAACTGATTGGACGTTATTTATTACTCAGCTTATTGTTATTTGCCGGTTTATATTTCCTTGTCAGTCTGATTTATCAATATTTCCATGTTGAGTTACGTTTCTTATGGCCATTATTGAAGCCATTAACGACAGAGCGGTTTAATTTATTTATCGTGTATTGGTTACCTATTTTGGTCTTTTCTTCGTGTTCCAACGGTTTAAT-3'；(SEQIDNO.4)所述阴性对照为pEASY-Y3空载质粒标准品。所述实时荧光定量PCR(qPCR)试剂为现有技术中已有的常规试剂。第三方面，本专利技术提供一种非诊断目的的检测环境气溶胶样本中多杀性巴氏杆菌的方法，步骤如下：(1)采集环境气溶胶样本；(2)提取气溶胶样本的基因组总DNA；(3)以提取的基因组总DNA为模板，采用上述的试剂盒进行扩增，根据扩增体系的扩增曲线对环境气溶胶样本中是否含有多杀性巴氏杆菌进行判断，扩增曲线Ct值≤37.0时，扩增曲线成S型曲线，则表明气溶胶样本中含有多杀性巴氏杆菌病原核酸，检测结果为阳性；当扩增曲线Ct值＞37.0时，扩增曲线为一条直线，则表明气溶胶样本中不含有多杀性巴氏杆菌病原核酸，检测结果为阴性。步骤(1)中，采集环境气溶胶样本的方法为：采用国际标准的全玻璃液体冲击式采样器(all-glass-impinger，简称AGI)，以30mL含0.01％(V/V)牛血清白蛋白的PBS(pH7.0)为采样介质，按照12.5L/min的采样流量采集30min，收集养殖场环境中的气溶胶样本。步骤(2)中，提取气溶胶样本的基因组总DNA的方法为：将采集到的气溶胶样本在室温下离心，弃上清液，应用细菌基因组DNA试剂盒(商业化产品，现有技术中的常规试剂盒)提取总DNA。步骤(3)中，扩增反应体系为20μL，包括2×ProbeqPCRMix10μL，模板1μL，10μmol/L的正向引物和反向引物各0.8μL，探针0.6μL，RNaseFreeddH2O6.8μL。步骤(3)中，扩增反应的条件为：预变性95℃30s，然后95℃变性5s、61℃退火延伸30s进行45个循环，每个循环结束后采集荧光信号，最后40℃30s反应结束。本专利技术的有益效果：(1)针对现有技术中对多杀性巴氏杆菌的防治现状及危害的分析，本专利技术选择多杀性巴氏杆菌Kmt1基因所共有的序列设计合成引物，建立TaqMan实时荧光定量PCR，可将养殖场气溶胶样本中多杀性巴氏杆菌和其它病原进行区分，并在养殖场环境中开展多杀性巴氏杆菌病的流行病学调查，对养殖场中不同环境区域，包括动物饲养舍、运动场、挤奶厅及产房等采集气溶胶样品，利用TaqMan实时荧光定量PCR检测多杀性巴氏杆菌的含量及其分布情况，预报巴氏杆菌病发生的风险，为场区卫生消毒试剂的选择、使用次数及重点消毒区域的确定提供参考。(2)本专利技术的试剂盒可以检测养殖场环境气溶胶中多杀性巴氏杆菌，具有简捷快速、灵敏特异、低廉准确及实用性强等优点。利用本专利技术的方法可以对养殖场环境气溶胶中的多杀性巴氏杆菌的流行与隐性感染进行群体监测，为养殖场多杀性巴氏杆菌病的防控提供技术支持，也可以开展多杀性巴氏杆菌病的流行病学调查，为多杀性巴氏杆菌病的科学防控提供理论支撑。(3)本专利技术建立的TaqMan实时荧光定量PCR检测环境气溶胶样本中多杀性巴氏杆菌方法，通过倍比稀释质粒标准品进行灵敏度检测，最低浓度为5.0个拷贝/反应。以多杀性巴氏杆菌、牛支原体、溶血曼氏杆菌、化脓隐秘杆菌、睡眠嗜组织菌、肺炎克雷伯菌、肺炎链球菌、丝状支原体丝状亚种SC型等基因组DNA等为模板，在建立的检测方法下进行扩增，结果表明仅有多杀性巴氏杆菌有阳性扩增，其他菌株扩增均为阴性，表明与其他菌株无交叉反应，具有很强的特异性。对3个不同浓度的阳性标准品进行了批内检测和批间检测，计算出批内变异系数和批间变异系数，其批内误差和批间误差均小于10本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测环境气溶胶样本中多杀性巴氏杆菌的引物和探针组合，其特征在于，包括正向引物、反向引物和探针；其正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列如SEQ ID NO.2所示，探针序列如SEQ ID NO.3所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测环境气溶胶样本中多杀性巴氏杆菌的引物和探针组合，其特征在于，包括正向引物、反向引物和探针；其正向引物序列如SEQIDNO.1所示，反向引物序列如SEQIDNO.2所示，探针序列如SEQIDNO.3所示。2.权利要求1所述的引物和探针组合在制备环境气溶胶样本中多杀性巴氏杆菌检测的试剂盒、芯片和/或扩增反应试剂中的用途。3.一种检测环境气溶胶样本中多杀性巴氏杆菌的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含权利要求1所述的引物和探针组合。4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：阳性标准质粒、阴性对照和实时荧光定量PCR(qPCR)试剂。5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性标准质粒由含有如SEQIDNo.4所示的核苷酸片段构成的pEASY-T3重组质粒组成。6.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为pEASY-Y3空载质粒标准品。7.一种非诊断目的的检测环境气溶胶样本中多杀性巴氏杆菌的方法，步骤如下：(1)采集环境气溶胶样本；(2)提取气溶胶样本的基因组总DNA；(3)以提取的基因组总DNA为模板，采用上述的试剂盒进行扩增，根据扩增体系...

【专利技术属性】
技术研发人员：何洪彬，赵贵民，侯佩莉，王洪梅，
申请(专利权)人：山东师范大学，
类型：发明
国别省市：山东,37