一种检测MET基因14外显子突变的探针库、检测方法和试剂盒技术

本发明专利技术提供一种检测MET基因14外显子突变的探针及检测方法，所述DNA探针库包括一个或多个能够与MET基因14外显子及相邻内含子进行杂交的DNA探针。所述DNA探针可以如SEQ ID NO.1～46所示。此外，本发明专利技术提供利用该探针库对MET基因14外显子及相邻内含子进行富集及检测的方法，采用此方法与下一代测序技术（NGS）相结合可以极大地提高MET14基因检测的敏感性，准确性与全面性。

【技术实现步骤摘要】
一种检测MET基因14外显子突变的探针库、检测方法和试剂盒
本专利技术涉及基因检测领域，具体而言，本专利技术涉及一种检测MET基因14外显子突变的探针及检测方法。该方法可以精准地富集MET基因14外显子突变序列，所得DNA样本库可进一步结合下一代测序技术（NGS），精准地判断病人的MET基因14外显子突变情况，并为相关肿瘤的诊断，预后，及临床治疗方案的设计提供指导及理论基础。
技术介绍
原发性肺癌（以下简称肺癌），发生于支气管粘膜上皮，故亦称支气管肺癌，是最常见的肺部原发性恶性肿瘤，也是我国最常见的恶性肿瘤之一，严重危害民众的生命与健康。在我国，肺癌发病率和死亡率在男性常见恶性肿瘤中均占首位；在女性常见恶性肿瘤中分别占第一、二，仅次于乳腺癌的死亡人数。根据全国肿瘤登记中心2014年发布的数据显示，2010年，我国新发肺癌病例60.59万(男性41.63万，女性18.96万)，占恶性肿瘤新发病例的19.59％(男性23.03％，女性14.75％)。肺癌发病率为35.23/10万(男性49.27/10万，女性21.66/10万)。同期，我国肺癌死亡人数为48.66万(男性32.58万，女性16.08万)，占恶性肿瘤死因的24.87％(男性26.85％，女性21.32％)。肺癌死亡率为27.93/10万(男性39.79/10万，女性16.62/10万)。从分布来看，上海、北京、东北和沿海地区的几个较大城市的死亡率最高。目前肺癌的治疗方式主要是手术、化疗、放疗，其中化疗是中晚期肺癌的主要治疗方式，但是其毒副作用较大，且个体间治疗疗效差异较大。随着肿瘤生物学的发展，及肿瘤发生机制的进一步探索，分子靶向治疗因其治疗有效率高、毒副作用小的特点，逐渐成为晚期肺癌的常规临床治疗方案。MET蛋白由原癌基因c-MET编码，是肝细胞生长因子HGF的受体。MET与多种细胞行为相关，参与细胞的信号传导、细胞骨架重排，促进细胞的增殖与分化。通过基因扩增或者过表达的方式激活MET的激酶活性可以促使细胞的癌变（8-10）。MET扩增在未经治疗的非小细胞肺癌（NSCLC）患者中并不常见，发生频率约为2-4%（8,9,11）。从2014年首次发现MET基因14外显子跳读突变到现在，已经有多个研究针对不同的肿瘤类型对该突变类型进行研究。MET基因14外显子跳读突变在肺腺癌中的发生频率约为4%，而在肺肉瘤样癌中的频率高达22%。该突变的机理是，MET基因14外显子是MET蛋白泛素化降解过程中的结合位点，其丢失会导致MET蛋白无法被泛素化降解，从而引起MET蛋白的持续表达。在非小细胞肺癌中，携带MET基因14外显子跳读突变的患者对MET抑制剂（克唑替尼、卡博替尼）在临床试验中有较好的应答。并且该突变与EGFR、ALK、KRAS、BRAF等突变不共存，意味着该靶点在肺腺癌中有较高的特异性。所以在NCCN指南中，建议MET基因14外显子跳读的患者选择克唑替尼进行治疗。MET基因14外显子跳读也成为肺腺癌中重要的一类分子分型。MET基因14外显子跳读突变检测目前只有实时荧光定量PCR的试剂盒，其特点是检测方法简单，易于操作，但是需要提取RNA，对样本要求较高，实验结果判读较复杂，并且一次只能检测MET基因14外显子跳读突变，无法同时检测其它突变类型，所以实际上应用范围有限。现有的主流基因突变检测方法主要集中于以下3个技术：1）PCR突变检测基于PCR片段扩增和凝胶电泳分离的方法，从而分辨出野生型和突变性的差异。其缺点包括：其为单碱基突变类型检测，不能对mRNA进行定量，不能检测基因颠换；敏感性低；耗时长，单次只能检测一个基因突变；不能确定碱基的具体变化；无法进行高通量检测。2）Q-PCR（定量PCR）检测基于荧光和PCR片段扩增来对模板mRNA多少来进行定量。其缺点包括：不能检测单碱基类型突变；不能检测基因颠换；只能检测已知突变；耗时长，单次只能检测一个基因突变；不能确定碱基的具体变化。3）基因芯片技术用高精度技术将DNA片段打印在芯片上，然后通过DNA杂交结合特性来确定突变性质。其缺点包括：不能检测基因颠换；只能检测已知突变；成本高，通量较小；准确率低，通常需要重复2次以上才能确定结果。
技术实现思路
针对上述技术问题，本专利技术人通过大量实验，开发了用于检测MET基因14外显子突变的方法，该方法利用探针液相捕获、二代测序技术，不仅可以实现几千倍地富集的MET基因14外显子及其附近内含子的DNA片段，而且实现了较高的检测特异性和敏感性。本专利技术的第一个方面：一种检测MET基因14外显子突变的探针库，其中包括有核苷酸序列如SEQIDNO.1～46所示的任意一条探针，或者与其具有相同功能的探针。优选的：探针库中包括上述的全部探针。优选的：所述的具有相同功能的探针，是指将SEQIDNO.1～46任意一条探针经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同杂交捕获功能的探针。优选的：所述的具有相同功能的探针与原探针具有80%以上相同的碱基，更优选是90%以上相同碱基，再优选是95%以上相同碱基。本专利技术的第二个方面：本专利技术提供一种富集MET基因14外显子及其附近内含子片段的方法，所述方法包括以下步骤：1）获得受试者的DNA样本库；2）获得所述的检测MET基因14外显子突变的探针；3）使所述DNA探针库与所述DNA样本库进行杂交；和4）分离步骤3）的杂交产物，然后释放经杂交富集的MET基因14外显子及其附近内含子DNA片段。其中，所述步骤1）中的DNA样本库由双链DNA片段组成，并且，所述步骤1）包括：1-1）提取全基因组DNA，然后将其片段化；或者1-2）提取mRNA，将其片段化，然后以该经片段化的mRNA为模板合成双链cDNA；其中，所述受试者为哺乳动物，优选人，且从受试者的细胞、组织或体液样本中提取全基因组DNA或mRNA；优选地，所述DNA片段的长度为150～600bp；进一步优选地，所述DNA片段的长度为150～200bp。所述步骤2）中的DNA探针库为如上所述的DNA探针库。具体而言，所述DNA探针库包括一个或多个能够与MET基因14外显子杂交的DNA探针，所述DNA探针如以下序列所示：SEQIDNO.1～46。此外，所述步骤3）包括：3-1）采用选择性标记标记DNA探针库中的DNA探针；和3-2）使所述DNA探针库与DNA样本库进行杂交；优选地，所述步骤3-1）中的选择性标记为生物素；进一步优选地，所述步骤3-2）包括在PCR扩增仪中，在65℃下将所述DNA探针库与DNA样本库孵育24小时。因此，所述方法的步骤4）中，优选利用DNA探针上的选择性标记分离杂交产物。进一步优选地，所述步骤3-1）中的选择性标记为生物素，所述步骤4）中利用链霉亲和素-生物素的亲和作用分离杂交产物。本专利技术的第三个方面：本专利技术还提供一种检测MET基因14外显子突变的方法，所述方法包括以下步骤：1）根据上述方法富集MET基因14外显子及其附近内含子的DNA片段；和2）检测所述MET基因14外显子的突变。优选地，所述步骤2）中采用下一代测序技术，通过对富集到的MET基因14外显子片段进行测序而检测所述MET基因14外显子片段的突变。本专利技术的第四个方面：本专利技术提供一种用于检本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测MET基因14外显子突变的探针库，其特征在于，包括有核苷酸序列如SEQ ID NO. 1～46所示的任意一条探针，或者与其具有相同功能的探针。

【技术特征摘要】
2017.02.22 CN 20171009613031.一种检测MET基因14外显子突变的探针库，其特征在于，包括有核苷酸序列如SEQIDNO.1～46所示的任意一条探针，或者与其具有相同功能的探针。2.根据权利要求1所述的检测MET基因14外显子突变的探针库，其特征在于，优选的：探针库中包括上述的全部探针；优选的：所述的具有相同功能的探针，是指将SEQIDNO.1～46任意一条探针经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同杂交捕获功能的探针；优选的：所述的具有相同功能的探针与原探针具有80%以上相同的碱基，更优选是90%以上相同碱基，再优选是95%以上相同碱基。3.一种富集MET基因14外显子基因片段的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1）获得受试者的DNA样本库；2）获得权利要求1所述的检测MET基因14外显子突变的探针库；3）使所述探针库与所述DNA样本库进行杂交；和4）分离步骤3）的杂交产物，然后释放经杂交富集的MET基因14外显子基因片段。4.根据权利要求3所述的富集MET基因14外显子基因片段的方法，其特征在于，所述步骤1）中的DNA样本库由双链DNA片段组成，并且，所述步骤1）包括：提取全基因组DNA，然后将其片段化；或者提取mRNA，将其片段化，然后以该经片段化的mRNA为模板合成双链cDNA；其中，所述受试者为哺乳动物，优选人，且从受试者的细胞、组织或体液样本中提取全基因组DNA或mRNA；优选地，所述DNA片段的长度为150～600bp；...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵阳，吴雪，那成龙，赵忞超，王延宾，
申请(专利权)人：南京世和基因生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32