检测ABO血型基因型的方法和ABO血型基因座的等位基因分型标准物的模板技术

本发明专利技术公开了检测ABO血型基因型的方法和ABO血型基因座的等位基因分型标准物的模板。本发明专利技术所提供的方法，包括如下步骤：以待测样本的基因组DNA或总DNA为模板，采用引物组合进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，然后确定含有哪几种等位基因，进一步确定待测样本的ABO血型基因型。引物组合由6条引物组成，核苷酸序列依次为序列表中的序列1至序列6。实验证明，采用本发明专利技术提供的方法检测ABO血型基因型，准确率为100％；采用本发明专利技术提供的重组质粒组合物作为ABO血型基因座的等位基因分型标准物的模板，可扩增获得ABO血型基因座的等位基因分型标准物，并可在多种商业试剂盒中使用。本发明专利技术具有重要的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
检测ABO血型基因型的方法和ABO血型基因座的等位基因分型标准物的模板
本专利技术涉及法医学
，具体涉及检测ABO血型基因型的方法和ABO血型基因座的等位基因分型标准物的模板。
技术介绍
ABO血型是经典的人类遗传标记，在输血、亲子鉴定、人类学研究、法医物证检验等领域均占据重要地位。针对ABO血型，传统的血清学检验方法是对抗原或抗体进行检验，而在法医物证检验中最为常用的方法是检验抗原物质，但由于ABO血型抗原是糖脂或糖蛋白，因此检验时易受抗原活性、抗体的特异性以及微生物的污染等因素的影响。尤其针对性犯罪中的混合斑检验，传统的血清学检验方法也有着无法克服的局限性，使得无法分离女性受害人和男性嫌疑人的血型物质，只能根据受害人的血型来推测嫌疑人的血型，一旦遇到受害人血型遮蔽的情况，则无法准确推断混合斑中男性物质的血型。1985年，Gill研究组将差异裂解法和DNA指纹图技术应用于法医学检验，成功的分别提取混合斑中精子DNA和女性DNA，解决了困扰法医物证检验多年的难题，这也使DNA技术检验混合斑中精子血型成为可能。1990年，Yamamoto等人报道了ABO血型基因的核苷酸序列，准确检测到各等位基因在DNA序列上不同的SNP位点碱基的差异，这些研究证实利用ABO血型基因上SNP位点的差异进行ABO血型的基因分型将是一种非常有效的方法，特别是对于法医学实践中微量或降解的检材，但是现有的ABO血型基因SNP分型仍有一些不足，例如无法重复；虽可以重复，但在毛细管电泳平台上的峰型易出现分叉、肩峰、不对称等等现象，导致无法准确读取分型。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何检测ABO血型基因型。为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了引物组合。本专利技术所提供的引物组合，可由引物ABO-F1、引物ABO-F2、引物ABO-F3、引物ABO-R1、引物ABO-R2和引物ABO-R3组成；所述引物ABO-F1可为如下A1)或A2)：A1)序列表中的序列1所示的单链DNA分子；A2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；所述引物ABO-F2可为如下A3)或A4)：A3)序列表中的序列2所示的单链DNA分子；A4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；所述引物ABO-F3可为如下A5)或A6)：A5)序列表中的序列3所示的单链DNA分子；A6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；所述引物ABO-R1可为如下A7)或A8)：A7)序列表中的序列4所示的单链DNA分子；A8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；所述引物ABO-R2可为如下A9)或A10)：A9)序列表中的序列5所示的单链DNA分子；A10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；所述引物ABO-R3可为如下A11)或A12)：A11)序列表中的序列6所示的单链DNA分子；A12)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子。所述引物组合的应用也属于本专利技术的保护范围。所述引物组合的应用可为(b1)或(b2)：(b1)制备用于检测ABO血型基因型的试剂盒；(b2)检测ABO血型基因型。含有所述引物组合的试剂盒也属于本专利技术的保护范围。所述试剂盒可用于检测ABO血型基因型。含有所述引物组合的试剂盒的制备方法也属于本专利技术的保护范围。含有所述引物组合的试剂盒的制备方法，可包括将各条引物单独包装的步骤。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了检测ABO血型基因型的方法。本专利技术所提供的检测ABO血型基因型的方法，具体可为方法一，包括如下步骤：以待测样本的基因组DNA或总DNA为模板，采用所述引物组合进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，然后进行如下判断：(d1)如果所述PCR扩增产物中含有DNA片段甲和DNA片段丁，且不含有DNA片段乙和DNA片段丙，则待测样本的ABO血型基因型为AA；(d2)如果PCR扩增产物中含有所述DNA片段甲、所述DNA片段乙和所述DNA片段丁，且不含有所述DNA片段丙，则待测样本的ABO血型基因型为AB；(d3)如果PCR扩增产物中含有所述DNA片段甲、所述DNA片段丙和所述DNA片段丁，且不含有所述DNA片段乙，则待测样本的ABO血型基因型为AO；(d4)如果PCR扩增产物中含有所述DNA片段乙和所述DNA片段丁，且不含有所述DNA片段甲和所述DNA片段丙，则待测样本的ABO血型基因型为BB；(d5)如果PCR扩增产物中含有所述DNA片段甲、所述DNA片段乙、所述DNA片段丙和所述DNA片段丁，则待测样本的ABO血型基因型为BO；(d6)如果PCR扩增产物中含有所述DNA片段甲和所述DNA片段丙，且不含有所述DNA片段乙和所述DNA片段丁，则待测样本的ABO血型基因型为OO；所述DNA片段甲的核苷酸序列如序列表中的序列7所示；所述DNA片段乙的核苷酸序列如序列表中的序列8所示；所述DNA片段丙的核苷酸序列如序列表中的序列9所示；所述DNA片段丁的核苷酸序列如序列表中的序列10所示。上述方法中，所述“进行PCR扩增”的反应体系可由KCl、MgCl2、牛血清白蛋白、Tween-20、甘油、NaN3、dNTP、引物混合物、Taq金牌酶、模板和Tris-HCl缓冲液组成；引物混合物即为所述引物组合中的各条引物组成的混合物。反应体系中，KCl的浓度具体可为50mM，MgCl2的浓度具体可为1.6mM，牛血清白蛋白的浓度具体可为0.8mg/mL，Tween-20的浓度具体可为0.2％(v/v)，甘油的浓度具体可为3.2％(v/v)，NaN3的浓度具体可为0.02％(v/v)，dATP、dTTP、dGTP和dCTP的浓度具体均可为200μM，所述引物ABO-F1、所述引物ABO-F2、所述引物ABO-F3、所述引物ABO-R1、所述引物ABO-R2和所述引物ABO-R3的浓度具体均可为0.32μM，Taq金牌酶的浓度具体可为0.1U/μL，模板具体可为0.05ng/μL，Tris-HCl缓冲液的浓度具体可为pH8.3、20mM的Tris-HCl。上述方法中，所述“进行PCR扩增”的反应程序具体可为：95℃预变性11min；94℃变性30s，59℃退火2min，72℃延伸1min，28次循环；60℃延伸60min；4℃保存。本专利技术所提供的检测ABO血型基因型的方法，具体可为方法二，包括如下步骤：检测待测样本的基因组DNA或总DNA中是否含有所述DNA片段甲、所述DNA片段乙、所述DNA片段丙或所述DNA片段丁，然后进行如下判断：(e1)如果待测样本的基因组DNA或总DNA中含有所述DNA片段甲和所述DNA片段丁，且不含有所述DNA片段乙和所述DNA片段丙，则待测样本的ABO血型基因型为AA；(e2)如果待测样本的基因组DNA或总DNA中含有所述DNA片段甲、所述DNA片段乙和所述DNA片段丁，且不含有所述DNA片段丙，则待测样本的ABO血型基因型为AB；(e3本文档来自技高网...

【技术保护点】
引物组合，由引物ABO‑F1、引物ABO‑F2、引物ABO‑F3、引物ABO‑R1、引物ABO‑R2和引物ABO‑R3组成；所述引物ABO‑F1为如下A1)或A2)：A1)序列表中的序列1所示的单链DNA分子；A2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；所述引物ABO‑F2为如下A3)或A4)：A3)序列表中的序列2所示的单链DNA分子；A4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；所述引物ABO‑F3为如下A5)或A6)：A5)序列表中的序列3所示的单链DNA分子；A6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；所述引物ABO‑R1为如下A7)或A8)：A7)序列表中的序列4所示的单链DNA分子；A8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；所述引物ABO‑R2为如下A9)或A10)：A9)序列表中的序列5所示的单链DNA分子；A10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；所述引物ABO‑R3为如下A11)或A12)：A11)序列表中的序列6所示的单链DNA分子；A12)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子。...

【技术特征摘要】
1.引物组合，由引物ABO-F1、引物ABO-F2、引物ABO-F3、引物ABO-R1、引物ABO-R2和引物ABO-R3组成；所述引物ABO-F1为如下A1)或A2)：A1)序列表中的序列1所示的单链DNA分子；A2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；所述引物ABO-F2为如下A3)或A4)：A3)序列表中的序列2所示的单链DNA分子；A4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；所述引物ABO-F3为如下A5)或A6)：A5)序列表中的序列3所示的单链DNA分子；A6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；所述引物ABO-R1为如下A7)或A8)：A7)序列表中的序列4所示的单链DNA分子；A8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；所述引物ABO-R2为如下A9)或A10)：A9)序列表中的序列5所示的单链DNA分子；A10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；所述引物ABO-R3为如下A11)或A12)：A11)序列表中的序列6所示的单链DNA分子；A12)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子。2.权利要求1所述引物组合的应用，为(b1)或(b2)：(b1)制备用于检测ABO血型基因型的试剂盒；(b2)检测ABO血型基因型。3.含有权利要求1所述引物组合的试剂盒；所述试剂盒用于检测ABO血型基因型。4.权利要求3所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。5.一种检测ABO血型基因型的方法，包括如下步骤：以待测样本的基因组DNA或总DNA为模板，采用权利要求1所述引物组合进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，然后进行如下判断：(d1)如果所述PCR扩增产物中含有DNA片段甲和DNA片段丁，且不含有DNA片段乙和DNA片段丙，则待测样本的ABO血型基因型为AA；(d2)如果PCR扩增产物中含有所述DNA片段甲、所述DNA片段乙和所述DNA片段丁，且不含有所述DNA片段丙，则待测样本的ABO血型基因型为AB；(d3)如果PCR扩增产物中含有所述DNA片段甲、所述DNA片段丙和所述DNA片段丁，且不含有所述DNA片段乙，则待测样本的ABO血型基因型为AO；(d4)如果PCR扩增产物中含有所述DNA片段乙和所述DNA片段丁，且不含有所述DNA片段甲和所述DNA片段丙，则待测样本的ABO血型基因型为BB；(d5)如果PCR扩增产物中含有所述DNA片段甲、所述DNA片段乙、所述DNA片段丙和所述DNA片段丁，则待测样本的ABO血型基因型为BO；(d6)如果PCR扩增产物中含有所述DNA片段甲和所述DNA片段丙，且不含有所述DNA片段乙和所述DNA片段丁，则待测样本的ABO血型基因型为OO；所述DNA片段甲的核苷酸序列如序列表中的序列7所示；所述DNA片段乙的核苷酸序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：王乐，叶健，赵兴春，季安全，孙启凡，白雪，马温华，陈曼，
申请(专利权)人：公安部物证鉴定中心，
类型：发明
国别省市：北京,11