一种用于检测神经母细胞瘤的引物组及检测方法技术

本发明专利技术提供用于检测神经母细胞瘤的引物组及其检测方法，本发明专利技术的引物包括SEQ ID No.1‑‑SEQ ID No.18，可对PHOX2B、TH、CGA、DDC、DCX、MYCN、CCND1、ISL1、B4GALNT1基因进行联合检测。通过PCR或荧光定量PCR的方法，可在短时间内灵敏检测出靶基因的表达及表达水平；采用优化的PCR条件，使观察结果更显著，进一步提高本发明专利技术的适用性；扩增产物具有特异性，确保PCR检测的高准确度和灵敏度。实施本发明专利技术中用于神经母细胞瘤检测的引物组，通过检测病人样本中靶基因的表达，可以简单、方便且准确地诊断神经母细胞瘤。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测神经母细胞瘤的引物组及检测方法
本专利技术涉及肿瘤基因领域，具体涉及一种用于检测神经母细胞瘤的引物组及检测方法。
技术介绍
神经母细胞瘤是发生于交感神经节的恶性肿瘤，由未分化的神经母细胞组成，主要起源于肾上腺髓质、腹膜后、后纵隔，盆腔及颈部交感神经节。神经母细胞瘤是儿童最常见的颅外实体瘤，40％神经母细胞瘤病例在就诊时存在肿瘤转移。研究发现，病人的诊断年龄、疾病程度以及基因改变都影响了神经母细胞瘤的治疗效果。神经母细胞瘤具有很强的异质性，可在不经治疗的情况下自行消退，也可表现极具侵袭的恶性表型，对多种治疗手段没有反应而迅速恶化，因此对神经母细胞瘤的早期诊断十分必要。目前神经母细胞瘤的诊断方法包括影像学检查，细胞病理学和组织病理学诊断。影像学检查包括X射线、CT扫描、核磁共振检查等，但是其效率较低并且检测准确度不高。通常的细胞和组织病理学检测包括细胞活检，需要通过外科手术或者穿刺的方法从患者上获取肿瘤组织的检材。不但不方便，而且会对患者造成人体伤害。近来，循环肿瘤细胞(CirculatingTumorCells，CTCs)检测的出现给患者的检测带来了新的希望。CTCs是从肿瘤病灶脱离并移位至血液中的肿瘤细胞，是恶性肿瘤患者术后复发和远处转移的重要原因，也是导致肿瘤患者死亡的重要因素。与其他组织学标本如骨髓等相比，外周血标本容易获取，且对患者创伤小，是临床上常规检测较为理想的标本来源。CTCs检测有助于肿瘤的早期诊断、判断患者预后、评估抗肿瘤药物的疗效及制定个体化治疗方案。与传统的诊断方法相比，CTCs检测可更加敏感地发现疾病的变化，且对患者没有副作用。CTC的检测通常通过抽取一定体积的血液进行。检测分为两类，包括不捕获(富集)直接检测和先捕获(富集)后检测，其中后者为主流的检测方法。先捕获(富集)后检测的方法也分为两类，即正选和负选。正选主要是通过CTC表面标志物或细胞的物理性质(大小、密度)进行捕获；前者是基于免疫磁球技术和微流控芯片技术，后者是基于过滤、离心的原理。负选则是通过白细胞表面标志物间接捕获CTC。然而基于先捕获(富集)后检测的方法有着明显的缺陷。它严重依赖于肿瘤细胞表面标记物的表达，因此无法捕获未表达表面肿瘤标记物的CTC细胞。采用RT-PCR的方法检测CTC细胞的特异性基因是CTC细胞检测的另外一种方式。首先抽取一定体积的血液，通过密度梯度离心的方式富集CTCs，然后通过RT-PCR的方式检测特定基因的mRNA，以此判断CTCs是否存在，并通过检测CT值的变化给CTCs定量。这种方法检测CTCs费用低，敏感度高，而且容易自动化。目前采用RT-PCR方法检测神经母细胞瘤CTCs的标准还没有完全建立。我们通过检测神经母细胞瘤患者的CTCs特征基因，确定神经母细胞瘤CTCs的检测方法和检测标准。这些检测方法和标准的建立有助于肿瘤患者的早期诊断、判断患者预后、评估抗肿瘤药物,包括NK和CAR-T免疫治疗的疗效及制定个体化治疗方案。针对上述问题，本专利技术开发一种高灵敏的多基因联合检测方法，通过联合检测PHOX2B、TH、CGA、DDC、DCX、MYCN、CCND1、ISL1和B4GALNT19个基因实现肿瘤的早期检测。本专利技术设计和运用靶点特异性引物组，大幅度提高检测的灵敏度。该检测方法的检出率可达到98％，同时具备了灵敏度高，特异性好，快速准确等优点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种用于检测神经母细胞瘤的引物组及检测方法。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一种用于检测神经母细胞瘤的引物组，包含：本专利技术的引物组可通过以下两种方法实现神经母细胞瘤的检测。方法1：PCR方法。(1)将权利要求1所述的9对引物分别加入到单个PCR反应管中，并均加入核酸提取物、反转录酶、RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、dNTP；其中，PCR反应的每个循环的条件为94摄氏度、30s；55摄氏度、30s；72摄氏度、10s；(2)进行反转录和PCR反应，用琼脂糖凝胶电泳法进行检测。方法2：荧光定量PCR方法(1)将权利要求1所述的9对引物分别加入到单个PCR反应管中，并均加入核酸提取物、反转录酶、RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、dNTP；分别加入2×ChamQSYBRqPCRMasterMix，其中，PCR反应的每个循环的条件为95摄氏度、10s和60摄氏度、30s；40个循环；每管设立三个复孔；(2)进行反转录和PCR反应，并实时检测荧光；(3)根据荧光检测结果计算出的Ct值，判断是否有标志物靶基因表达于样品中。本专利技术的有益效果在于：本专利技术通过设计特异性PCR引物，开发出用于神经母细胞瘤早期检测的多基因联合检测方法。此方法：(1)建立的PCR体系可对PHOX2B、TH、CGA、DDC、DCX、MYCN、CCND1、ISL1和B4GALNT1基因进行联合检测；(2)通过同时对多个基因进行检测可使神经母细胞瘤检出率达到98％；(3)灵敏度高，低至1-5拷贝的基因表达水平均可检出；(4)特异性强，正常人或非神经母细胞瘤病人样本不会产生非特异性信号；(5)检测速度快，操作简单，费用低廉。附图说明图1为实施例中健康人外周血样本检测阴性PCR图。图2为实施例中非神经母细胞瘤患者外周血样本检测阴性PCR图。图3为实施例中非神经母细胞瘤患者癌组织样本检测阴性PCR图。图4为实施例中神经母细胞瘤患者外周血检测阳性PCR图。图5为实施例中神经母细胞瘤患者骨髓检测阳性PCR图。图中，M.100bpmarker；1.B2M；2.PHOX2B；3.TH；4.CGA；5.DDC；6.DCX；7.MYCN；8.CCND1；9.ISL1；10.B4GALNT1。具体实施方式本专利技术针对目前神经母细胞瘤中的肿瘤驱动基因，通过联合检测PHOX2B、TH、CGA、DDC、DCX、MYCN、CCND1、ISL1和B4GALNT19个基因实现神经母细胞瘤的早期检测。针对目前检测方法灵敏度低，检测过程复杂繁琐，检测所需时间长，无法满足临床检测的实际需求。针对上述问题，设计出用于检测上述9个基因的一整套特异性引物组。根据上述9个基因的参考序列设计特异性扩增引物，其PCR产物长度最优是在180-200bp之间，退火温度不高于60度，GC含量在40-60％之间，符合一般引物设计软件的要求。通过采用实时荧光PCR反应检测体系，实现多个基因联合的高灵敏检测，其检测方法如下所述。本专利技术结合附图和实施例作进一步的说明。如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉的《分子可隆实验指南》第三版(ColdSpringHarborlaboratoryPress)、《细胞实验指南》(科学出版社，北京，中国，2001年)、《RNA实验技术手册》(科学出版社，北京，中国，2004年)、《免疫检测技术》(科学出版社，北京，中国，1991)等实验手册以及本文所引用的参考文献中所列方法来实施。其中，所用的引物可以委托上海生工生物工程技术服务有限公司等公司合成。下面结合实施例对本专利技术作进一步说明。实施例1:基因选择多项研究表明，单基因筛查敏感度约为20-30％，大部分用于肿瘤早期筛查的单个基因检测，其检测敏感度或特异度偏低，不能满足临床需要。采用多基因联合检测可本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测神经母细胞瘤的引物组，其特征在于，所述引物组可以包含a～i9对引物，所述引物a的正向引物如SEQ ID No.1所示，引物a的反向引物如SEQ ID No.2所示，引物b的正向引物如SEQ ID No.3所示，引物b的反向引物如SEQ ID No.4所示，引物c的正向引物如SEQ ID No.5所示，引物c的反向引物如SEQ ID No.6所示，引物d的正向引物如SEQ ID No.7所示，引物d的反向引物如SEQ ID No.8所示，引物e的正向引物如SEQ ID No.9所示，引物e的反向引物如SEQ ID No.10所示,引物f的正向引物如SEQ ID No.11所示，引物f的反向引物如SEQ ID No.12所示,引物g的正向引物如SEQ ID No.13所示，引物g的反向引物如SEQ ID No.14所示,引物h的正向引物如SEQ ID No.15所示，引物h的反向引物如SEQ ID No.16所示,引物i的正向引物如SEQ ID No.17所示，引物i的反向引物如SEQ ID No.18所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测神经母细胞瘤的引物组，其特征在于，所述引物组可以包含a～i9对引物，所述引物a的正向引物如SEQIDNo.1所示，引物a的反向引物如SEQIDNo.2所示，引物b的正向引物如SEQIDNo.3所示，引物b的反向引物如SEQIDNo.4所示，引物c的正向引物如SEQIDNo.5所示，引物c的反向引物如SEQIDNo.6所示，引物d的正向引物如SEQIDNo.7所示，引物d的反向引物如SEQIDNo.8所示，引物e的正向引物如SEQIDNo.9所示，引物e的反向引物如SEQIDNo.10所示,引物f的正向引物如SEQIDNo.11所示，引物f的反向引物如SEQIDNo.12所示,引物g的正向引物如SEQIDNo.13所示，引物g的反向引物如SEQIDNo.14所示,引物h的正向引物如SEQIDNo.15所示，引物h的反向引物如SEQIDNo.16所示,引物i的正向引物如SEQIDNo.17所示，引物i的反向引物如SEQIDNo.18所示。2.一...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐以兵，李凯，王金湖，董岿然，朱莉莉，朱珍芳，
申请(专利权)人：浙江大学，复旦大学附属儿科医院，浙江大学医学院附属儿童医院，上海博慷生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33