【技术实现步骤摘要】
一种利用小鼠肾细胞系统评价眼刺激性的方法
本专利技术涉及一种利用小鼠肾细胞系统评价眼刺激性的方法,适用于化妆品原料刺激性的评价,尤其适用于表面活性剂的眼刺激性评价。
技术介绍
表面活性剂是一种重要的精细化工产品,在国内外被广泛应用,它被誉为“工业味精”,能使溶液表面张力显著下降。表面活性剂广泛应用于化妆品调制、食品加工、农药和医药加工、纺织印染及洗涤剂生产等许多工业领域。表面活性剂用于生产化妆品或洗涤剂时,与消费者眼睛接触的几率大大增加,往往对消费者的眼睛存在一定刺激性甚至腐蚀性。家兔眼刺激试验(Draizetest)是检测化学物眼刺激性的经典方法,近年来,随着实验动物使用3R原则的倡导与实施以及生物医学研究模式的转变,替代动物实验的体外模型研究已经成为毒理学评价的趋势。根据体内眼损伤发生的机理,目前尚在开发的眼刺激替代方法可分为细胞系统、鸡胚、人工角膜和离体器官四类,与其它三类相比,细胞系统标准化程度最高、成本最低而且快速。细胞系统替代内动物实验的原理是基于大多数具有眼刺激作用的物质也具有细胞毒性,因此可根据化学物质对细胞膜损伤和对细胞质内蛋白质大分子破坏的相关性建立体外方法。用于体外测试的细胞包括成纤维细胞、血细胞、犬肾细胞等,目前基于标准化实验动物小鼠肾细胞系统建立的体外方法还未见相关专利和文献报道。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的缺点与不足,本专利技术的首要目的在于提供一种利用小鼠肾细胞系统评价眼刺激性的方法,该方法准确性高、快速、简便、成本低、对检测仪器无特殊要求。本专利技术所提供的利用小鼠肾细胞系统评价眼刺激性的方法,是通过检测暴露于受试物后 ...
【技术保护点】
一种利用小鼠肾细胞系统评价眼刺激性的方法,其特征在于包括以下步骤:一、小鼠肾细胞的制备取小鼠肾脏上皮,剪碎,研磨后用培养液冲洗,收集液体,经150目不锈钢网筛冲洗并收集网上肾细胞,加1g/L胶原酶I消化培养,37℃消化,每隔5min振荡1次,15min后加等体积含有10%牛胎血清的培养液终止消化,吹打分散细胞后静置5min,1000r/min离心5min,去除上清液,加入含10%牛胎血清的培养液,置于培养箱培养至细胞长满培养皿的85%以上,消化、冻存备用;二、小鼠肾细胞生长培养膜的制备取步骤一中冻存备用的对数生长期的小鼠肾细胞,调节细胞浓度为4×10
【技术特征摘要】
1.一种利用小鼠肾细胞系统评价眼刺激性的方法,其特征在于包括以下步骤:一、小鼠肾细胞的制备取小鼠肾脏上皮,剪碎,研磨后用培养液冲洗,收集液体,经150目不锈钢网筛冲洗并收集网上肾细胞,加1g/L胶原酶I消化培养,37℃消化,每隔5min振荡1次,15min后加等体积含有10%牛胎血清的培养液终止消化,吹打分散细胞后静置5min,1000r/min离心5min,去除上清液,加入含10%牛胎血清的培养液,置于培养箱培养至细胞长满培养皿的85%以上,消化、冻存备用;二、小鼠肾细胞生长培养膜的制备取步骤一中冻存备用的对数生长期的小鼠肾细胞,调节细胞浓度为4×105~10×105个/mL,取0.5mL加入到插入式培养皿中的微孔滤膜表面上培养72~96h,待细胞完全融合后,得到小鼠肾细胞生长培养膜;三、荧光素渗漏试验3.1检测范围确定实验将0.4mL,0.01g/100mL、0.1g/100mL、1g/100mL、10g/100mL、20g/100mL、50g/100mL用PBS缓冲液稀释的受试物溶液到步骤二中的插入式培养皿中的小鼠肾细胞生长培养膜上,每个受试物浓度设置3孔平行对照,作用5~20min后,用Hank’s液轻轻冲洗细胞生长培养膜至其表面没有受试物;然后再将清洗之后的带有小鼠肾细胞生长培养膜的插入式培养皿放入另一含新鲜的10%牛胎血清的培养液的培养皿中,加入5~20μg/mL的等体积的荧光素钠溶液到插入式培养皿中的小鼠肾细胞生长培养膜上,37℃继续培养10~30min,然后用Hank’s液轻轻清洗细胞生长膜至其表面没有受试物,用荧光分光光度计检测含10%牛胎血清的培养液的培养皿中每孔培养基中的荧光素量;3.2荧光素渗漏试验从范围确定实验的结果得到使荧光素渗漏的效应发生的大概浓度范围,根据上述范围进行合理的间隔,按照几何对数或者最少设置六个浓度梯度,从而得到精确的评估荧光素漏出量的受试物初浓度,并依次确定以下指标:(1)受试物各浓度对应的3个平行孔荧光素漏出量的确定;(2)不加受试物的溶剂对照组的荧光素漏出量的确定;(3)无细胞生长培养膜的最大渗透组的荧光素漏出量的确定;(4)受试物浓度-荧光素漏出率标准曲线的确定;(5)使荧光素漏出率为20%时的受试物浓度的确定;(6)接触受试物溶液后使荧光素漏出率为20%时的肾细胞生长培养膜继续培养4h、24h、36h、72h后的荧光素漏出率的确定;3.3荧光素渗漏试验结果分析实验获得反应小鼠肾细胞受损情况相关的三个参数:(1)FL(%);代表不同受试物浓度下的荧光素漏出百分比,按以下公式计算不同受试物浓度下的荧光素漏出百分比:FL(%)=(m-y)/(z-y)×100m表示受试物各浓度对应的3个平行孔荧光素漏出量的平均值,y表示同一块插入式培养皿不加受试物的溶剂对照组的荧光素钠漏出量的平均值,z表示同一块插入式培养皿无细胞生长培养膜的最大渗透组的荧...
【专利技术属性】
技术研发人员:程建华,郑华生,张鹏,谢培镇,谢明容,陈杰烽,黄桂州,何衍健,
申请(专利权)人:华南协同创新研究院,
类型:发明
国别省市:广东,44
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