一种利用甘露糖制备甘露糖‑6‑磷酸的方法技术

本发明专利技术涉及一种利用甘露糖制备甘露糖‑6‑磷酸的方法。包括以下步骤：(1)D‑甘露糖的制备；(2)配制反应液，将步骤(1)制得的D‑甘露糖、腺苷三磷酸钠盐和/或六偏磷酸钠、MgCl2溶解在去离子水中，用Tris‑Hcl缓冲液调节pH值；其中D‑甘露糖浓度为300‑800mmol/L，腺苷三磷酸钠盐和/或六偏磷酸钠浓度为500‑1500mmol/L，MgCl2浓度为10‑100mmol/L，pH值为4‑9；(3)加入己糖激酶混合，然后将其置于反应温度15‑50℃的摇床上反应，100rpm震荡温育使之进行转化反应5‑48小时；(4)加入活性炭脱色，过滤；(5)加入KOH，然后利用SSMB进行分离提纯，浓缩，干燥即得。通过对D‑甘露糖制备工艺参数，酶促反应合成甘露糖‑6‑磷酸工艺参数的优化，使得原料选择更加简单，合成效率更高，甘露糖‑6‑磷酸的纯度达到99%以上。

【技术实现步骤摘要】
一种利用甘露糖制备甘露糖-6-磷酸的方法
本专利技术属于生物化工领域，特别涉及一种酶法制备甘露糖-6-磷酸的方法。
技术介绍
甘露糖-6-磷酸（英语：Mannose-6-phosphate，M6P）是一个在免疫系统中与凝集素结合的分子，M6P可由磷酸甘露糖异构酶转化为果糖-6-磷酸。在蛋白质代谢过程中，与细胞核内体、细胞膜和细胞外分泌物有关的蛋白质必须经过修饰才能转运到细胞中的最终位置。6-磷酸甘露糖(mannose-6-phosphate,M-6-P)就是广泛存在于生命体中的与蛋白质修饰密切相关的磷酸化糖类化合物。M-6-P与其相应的受体6-磷酸甘露糖受体(mannose-6-phosphatereceptor,M-6-Preceptor)结合，在溶酶体酶发生效应的过程中起着重要的作用，M-6-P是溶酶体酶的分拣员和投送员。专利号201080035798.3中提到了甘露糖-6-磷酸及其盐、其前体或其类似物有减少皮肤发红的用途，同时具有美容效果，并且能够加快受损皮肤的愈合。近年来，以M-6-P为前体的药物研究日益受到关注，人们对于M-6-P的需求也随之提升。因此，寻找一种大规模生产M-6-P的方法是非常有必要的。目前，人们大多数采用化学法来合成M-6-P的类似物，而利用酶法来合成M-6-P非常的少。化学法基本都是以甲基α-D-吡喃甘露糖苷或者甲基2,3,4-三-O-b苯甲基-α-D-吡喃甘露糖苷为起始物经过3-5步的合成步骤，形成与M-6-P具有相似结构的类似物。合成过程所需要的条件比较苛刻，需要低温环境或者需要重金属或有毒试剂的参与，并且总回收率也不高。相比于化学法合成M-6-P的类似物来说，酶法合成M-6-P具有催化效率高、反应条件温和的优点，且无需有机试剂以及重金属的参与，更加有利于后期的药物合成。本专利技术提供了一种利用甘露糖制备甘露糖-6-磷酸的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种甘露糖制备甘露糖-6-磷酸的方法，通过对D-甘露糖制备工艺参数，酶促反应合成甘露糖-6-磷酸工艺参数的优化，使得原料选择更加简单，工艺流程明了详细，合成效率更好，同时制备得到的甘露糖-6-磷酸的纯度更高，达到99%以上。本专利技术的技术方案如下：一种利用甘露糖制备甘露糖-6-磷酸的方法，包括以下步骤：(1)D-甘露糖的制备：a.将摩尔比(1-10)：(1-2)葡萄糖和果糖用纯化水稀释到浓度25-65％(质量)，加入催化剂钼酸盐，所述钼酸盐与葡萄糖和果糖质量之和的比值为0.1-1：50，在50-110℃的真空条件下进行差向异构，得到的异构混合液；b.将步骤a得到的葡萄糖、果糖、甘露糖的混合液，进行脱盐精制后进入模拟移动床进行分离提纯，得到富含甘露糖的组分A和其他组分B；将其他组分B返回到步骤a进行差向异构；c将步骤b得到的富含甘露糖的组分A，进行一次蒸发然后加入活性炭进行脱色，经脱色处理后，进行二次蒸发，得到料液，该料液进行水相结晶，结晶过程中的降温梯度控制：0～6小时，每小时降0.5-1℃；7～18小时，每小时降1-2℃；19小时以后，每小时降0.5-1℃，直至降至20～30℃，结晶后经离心精制，得到粗品结晶D-甘露糖，以20-40％的无水乙醇对粗D-甘露糖进行15-60分钟浸泡精制，干燥后得到D-甘露糖成品;(2)配制反应液，将步骤(1)制得的D-甘露糖、腺苷三磷酸钠盐和/或六偏磷酸钠、MgCl2溶解在去离子水中，用Tris-Hcl缓冲液调节pH值；其中D-甘露糖浓度为300-800mmol/L，腺苷三磷酸钠盐和/或六偏磷酸钠浓度为500-1500mmol/L，MgCl2浓度为10-100mmol/L，pH值为4-9；(3)加入己糖激酶混合，然后将其置于反应温度15-50℃的摇床上反应，100rpm震荡温育使之进行转化反应5-48小时；(4)加入活性炭脱色，过滤；(5)加入KOH，然后利用SSMB进行分离提纯，浓缩，干燥即得。优选地，步骤(1)中，葡萄糖和果糖的摩尔比(9-10)：(1-1.2)，用纯化水稀释到浓度38％(质量)，所述钼酸盐与葡萄糖和果糖质量之和的比值为0.8-1：50。优选地，步骤(2)中，D-甘露糖浓度为500-800mmol/L，腺苷三磷酸钠盐和/或六偏磷酸钠浓度为500-1200mmol/L，-甘露糖与腺苷三磷酸钠盐和/或六偏磷酸钠摩尔比为1：2.3。优选地，步骤(2)中，MgCl2浓度为D-甘露糖浓度的1/3-1/9。优选地，步骤(2)中，pH值为6.5-8.8。优选地，腺苷三磷酸钠盐与六偏磷酸钠摩尔比为1-10：10-1。本专利技术具有以下有益效果：(1)本专利技术使用酶法合成M-6-P，相比于化学法合成M-6-P的类似物来说，酶法合成M-6-P具有催化效率高、反应条件温和、高效、绿色安全等优点，且只需从市场获得己糖激酶即可以作为原料，利于工业化生产；(2)本专利技术通过对D-甘露糖制备工艺参数，酶促反应合成甘露糖-6-磷酸工艺参数的优化，使得原料选择更加简单，工艺流程明了详细，合成效率更好，同时制备得到的甘露糖-6-磷酸的纯度更高，达到99%以上。本专利技术的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本专利技术而了解。本专利技术的主要目的和其它优点可通过在说明书、权利要求书中所特别指出的方案来实现和获得。附图说明附图仅用于示出具体实施例的目的，而并不认为是对本专利技术的限制，在整个附图中，相同的参考符号表示相同的部件。图1为利用甘露糖制备甘露糖-6-磷酸的工艺流程图。具体实施方式实施例1一种利用甘露糖制备甘露糖-6-磷酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)D-甘露糖的制备：a.将摩尔比8：1葡萄糖和果糖用纯化水稀释到浓度40％(质量)，加入催化剂钼酸盐，所述钼酸盐与葡萄糖和果糖质量之和的比值为0.2：50，在65℃的真空条件下进行差向异构，得到的异构混合液；b.将步骤a得到的葡萄糖、果糖、甘露糖的混合液，进行脱盐精制后进入模拟移动床进行分离提纯，得到富含甘露糖的组分A和其他组分B；将其他组分B返回到步骤a进行差向异构；c将步骤b得到的富含甘露糖的组分A，进行一次蒸发然后加入活性炭进行脱色，经脱色处理后，进行二次蒸发，得到料液，该料液进行水相结晶，结晶过程中的降温梯度控制：0～6小时，每小时降0.5℃；7～18小时，每小时降1.5℃；19小时以后，每小时降0.5℃，直至降至26℃，结晶后经离心精制，得到粗品结晶D-甘露糖，以35％的无水乙醇对粗D-甘露糖进行40分钟浸泡精制，干燥后得到D-甘露糖成品；(2)配制反应液，将步骤(1)制得的D-甘露糖、腺苷三磷酸钠盐、MgCl2溶解在去离子水中，用Tris-Hcl缓冲液调节pH值；其中D-甘露糖浓度为500mmol/L，腺苷三磷酸钠盐和/或六偏磷酸钠浓度为1300mmol/L，MgCl2浓度为12mmol/L，pH值为6；(3)加入己糖激酶（商业购买，sigma公司生产CAS：9001-51-8）混合，然后将其置于反应温度30℃的摇床上反应，100rpm震荡温育使之进行转化反应36小时；(4)加入活性炭脱色，过滤；(5)加入KOH，然后利用SSMB进行分离提纯，浓缩，干燥即得。转化率达到90%以上，提纯后的甘露糖-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用甘露糖制备甘露糖‑6‑磷酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)D‑甘露糖的制备：a.将摩尔比(1‑10)：(1‑2)葡萄糖和果糖用纯化水稀释到浓度25‑65％(质量)，加入催化剂钼酸盐，所述钼酸盐与葡萄糖和果糖质量之和的比值为0.1‑1：50，在50‑110℃的真空条件下进行差向异构，得到的异构葡萄糖、果糖、甘露糖混合液；b.将步骤a得到的葡萄糖、果糖、甘露糖的混合液，进行脱盐精制后进入模拟移动床进行分离提纯，得到富含甘露糖的组分A和其他组分B；将其他组分B返回到步骤a进行差向异构；c将步骤b得到的富含甘露糖的组分A，进行一次蒸发然后加入活性炭进行脱色，经脱色处理后，进行二次蒸发，得到料液，该料液进行水相结晶，结晶过程中的降温梯度控制：0～6小时，每小时降0.5‑1℃；7～18小时，每小时降1‑2℃；19小时以后，每小时降0.5‑1℃，直至降至20～30℃，结晶后经离心精制，得到粗品结晶D‑甘露糖，以20‑40％的无水乙醇对粗D‑甘露糖进行15‑60分钟浸泡精制，干燥后得到D‑甘露糖成品；(2) 配制反应液，将步骤(1)制得的D‑甘露糖、腺苷三磷酸钠盐和/或六偏磷酸钠、MgCl...

【技术特征摘要】
1.一种利用甘露糖制备甘露糖-6-磷酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)D-甘露糖的制备：a.将摩尔比(1-10)：(1-2)葡萄糖和果糖用纯化水稀释到浓度25-65％(质量)，加入催化剂钼酸盐，所述钼酸盐与葡萄糖和果糖质量之和的比值为0.1-1：50，在50-110℃的真空条件下进行差向异构，得到的异构葡萄糖、果糖、甘露糖混合液；b.将步骤a得到的葡萄糖、果糖、甘露糖的混合液，进行脱盐精制后进入模拟移动床进行分离提纯，得到富含甘露糖的组分A和其他组分B；将其他组分B返回到步骤a进行差向异构；c将步骤b得到的富含甘露糖的组分A，进行一次蒸发然后加入活性炭进行脱色，经脱色处理后，进行二次蒸发，得到料液，该料液进行水相结晶，结晶过程中的降温梯度控制：0～6小时，每小时降0.5-1℃；7～18小时，每小时降1-2℃；19小时以后，每小时降0.5-1℃，直至降至20～30℃，结晶后经离心精制，得到粗品结晶D-甘露糖，以20-40％的无水乙醇对粗D-甘露糖进行15-60分钟浸泡精制，干燥后得到D-甘露糖成品；(2)配制反应液，将步骤(1)制得的D-甘露糖、腺苷三磷酸钠盐和/或六偏磷酸钠、MgCl2溶解在去离子水中，用Tris-Hcl缓冲液调节pH值；其中D-甘露糖浓度为300-800mmol/L，腺苷三磷酸钠盐和/或六偏磷酸钠浓度为500-1500m...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾洪涛，孙立，张成亮，廖小雪，赵永强，姜鸿奇，
申请(专利权)人：内蒙古昶辉生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：内蒙古,15