葡萄溃疡病菌对葡萄致病力的评价方法技术

本发明专利技术公开了一种葡萄溃疡病菌对葡萄致病力的评价方法。该方法是：将培养在PDA平板上的菌株，打取菌饼置于改良Fries液体培养基中静置培养14天，离心收集上清，用针孔过滤器过滤排除菌丝、孢子和细菌污染，即完成粗毒素原液的制备。选择一年生绿枝条的新生幼嫩叶片，表面消毒后，打取直径为10mm的叶盘，吸取10μL粗毒素原液在叶盘中央部位接种，3天后测定病斑面积，评价葡萄溃疡病菌粗毒素原液的致病力。本发明专利技术操作简单、成本低、重复性好，为真菌毒素在葡萄溃疡病菌致病过程中作用研究与抗葡萄溃疡病葡萄品种选育研究提供了技术支撑。

【技术实现步骤摘要】
葡萄溃疡病菌对葡萄致病力的评价方法
本专利技术涉及农业生物
，涉及葡萄溃疡病菌对葡萄致病力的评价方法，具体涉及4种葡萄溃疡病菌(葡萄座腔菌Botryosphaeriadothidea、Lasiodiplodiatheobromae、小新壳梭孢Neofusicoccumparvum、Diplodiaseriata)粗毒素原液的制备与致病力评价方法。
技术介绍
由葡萄座腔菌科(Botryosphaeriaspp.)真菌引起的葡萄溃疡病是一种重要的葡萄病害。葡萄溃疡病主要发生在枝干、叶片和果实上，具体表现为树势衰减、枝干出现溃疡斑、叶片皱缩、果实脱落等。至今已发现葡萄座腔菌科中有21个种能引起葡萄溃疡病，在美国、日本、法国、新西兰等20多个国家广泛发生(URbez-TorresJR,PedutoF,StrieglerRK,etal.CharacterizationoffungalpathogensassociatedwithgrapevinetrunkdiseasesinArkansasandMissouri.FungalDiversity.2012:1-21.URbez-TorresJR,GublerWD.PathogenicityofBotryosphaeriaceaespeciesisolatedfromgrapevinecankersinCalifornia.PlantDisease.2009,93(6):584-592.)。近年来，研究表明葡萄座腔菌科真菌可分泌多糖、蜜蜂曲霉素、对羟苯基乙醇等真菌毒素导致寄主植物发生病害(MartosS,AndolfiA,LuqueJ,etal.ProductionofphytotoxicmetabolitesbyfivespeciesofBotryosphaeriaceaecausingdeclineongrapevines,withspecialinterestinthespeciesNeofusicoccumluteumandN.parvum.EuropeanJournalofPlantPathology,2008,121(4):451-461.DjoukengJD,PolliS,LarignonP,etal.IdentificationofphytotoxinsfromBotryosphaeriaobtusa,apathogenofblackdeadarmdiseaseofgrapevine.Europeanjournalofplantpathology,2009,124(2):303-308.Abou-MansourE,DébieuxJL,Ramírez-SueroM,etal.PhytotoxicmetabolitesfromNeofusicoccumparvum,apathogenofBotryosphaeriadiebackofgrapevine.Phytochemistry,2015,115:207-215.)，表明毒素是葡萄溃疡病菌的重要致病因子之一。目前，主要的葡萄溃疡病菌致病力评价方法，均需要接种活菌，实施需要大量的植物材料和病原菌，容易污染，耗时长等缺点。
技术实现思路
为了简便、直观的明确毒素在葡萄溃疡病菌在侵染葡萄过程中的作用，本专利技术提供获得一种操作简单、成本低、结果可靠的我国4种葡萄溃疡病菌优势种(Botryosphaeriadothidea、Lasiodiplodiatheobromae、Neofusicoccumparvum、Diplodiaseriata)粗毒素原液的制备方法。所述方法包括下述步骤：1)将葡萄溃疡病菌在PDA培养基上28℃培养48小时后，用5mm打孔器沿菌落边缘打取菌饼置于盛有100mL改良Fries的产毒液体培养基的500mL三角瓶中，6个菌饼/100mL培养基，28℃静置培养14d；2)将步骤1)中获得的培养物倒入50mL的无菌离心管中，常温下10000rpm(相当于11400g)离心8min；3)将步骤2)中上清用0.25μm的针式过滤器过滤至新的无菌离心管中，即为粗毒素原液。步骤1)中改良Fries的产毒液体培养基的配方为：每升中含蔗糖20g、酒石酸铵5g、硝酸铵1g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g、氯化钠0.1g、氯化钙0.13g、酵母浸膏1g，加超纯水至1L。本专利技术的另一目的在于提供一种利用上述粗毒素原液的进行葡萄溃疡病菌对葡萄致病力评价的方法，。具体步骤如下：1)将葡萄溃疡病菌在PDA培养基上28℃培养48小时后，用5mm打孔器沿菌落边缘打取菌饼置于盛有100mL改良Fries的产毒液体培养基的500mL三角瓶中，6个菌饼/100mL培养基，28℃静置培养14d；2)将步骤1)中获得的培养物倒入50mL的无菌离心管中，常温下10000rpm离心8min；3)将步骤2)中上清用0.25μm的针式过滤器过滤至新的无菌离心管中，即为粗毒素原液；4)选取不同葡萄品种一年生绿枝条顶端起第1至第4片叶子，用1％(w/v)进行消毒处理1min后，用灭菌水冲洗3遍，超净工作台中晾干备用；5)用直径为1cm的打孔器在经步骤4)处理的叶片上打取叶盘，并将其放入装有润湿灭菌滤纸的培养皿中；6)用移液器吸取步骤3)中制备的10μL粗毒素原液，接种在步骤5)中所述的叶盘的中心位置，25℃保湿培养3d后根据病斑面积大小评价不同葡萄溃疡病菌粗毒素原液的致病力。致病力的强弱是通过接种后叶盘上病斑面积大小来分级评价，病斑叶面积应用ImageJ软件进行测定，DPS数据处理系统进行显著性分析。葡萄溃疡病菌致病力评价标准：0级：无病斑；Ⅰ级：病斑面积范围在1-10mm2；Ⅱ级：病斑面积范围在10-20mm2；Ⅲ级：20-40mm2。本专利技术建立了一种操作简单、经济、可靠的葡萄溃疡病菌粗毒素原液的制备方法及其致病力评价方法。本方法的建立在选育抗葡萄溃疡病的葡萄品种方面也具有重要意义。附图说明图1为夏黑’、‘寒香蜜’和‘巨玫瑰’葡萄品种叶盘法接种葡萄溃疡病菌Diplodiaseriata菌株SDZ-013d后的结果，其中a是对照，为‘夏黑’接种无菌水3d后的结果；b为‘夏黑’接种改良Fries培养基培养菌株SDZ-01的粗毒素原液3天后的结果；c为‘夏黑’接种改良Czapeck培养基培养菌株SDZ-01的粗毒素原液3天后的结果；d是对照，为‘寒香蜜’接种无菌水3d后的结果；e为‘寒香蜜’接种改良Fries培养基培养菌株SDZ-01的粗毒素原液3天后的结果；f为‘寒香蜜’接种改良Czapeck培养基培养菌株SDZ-01的粗毒素原液3天后的结果；g是对照，为‘巨玫瑰’接种无菌水3d后的结果；h为‘巨玫瑰’接种改良Fries培养基培养菌株SDZ-01的粗毒素原液3天后的结果；i为‘巨玫瑰’接种改良Czapeck培养基培养菌株SDZ-01的粗毒素原液3天后的结果。具体实施方式为了更好的理解本专利技术，下面结合具体实施例对本专利技术做进一步的说明。下述实施例中所用的材料、试剂，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施实施例中所用葡萄溃疡病菌菌株(Lasiodiplodiatheobromae)GX-5-5A、Sxg-01s-1、SDZ-01和AH本文档来自技高网...

【技术保护点】
葡萄溃疡病菌粗毒素原液的制备方法，包括下述步骤：1)将葡萄溃疡病菌在PDA培养基上28℃培养48小时后，用5mm打孔器沿菌落边缘打取菌饼置于盛有100mL产毒液体培养基的500mL三角瓶中，6个菌饼/100mL培养基，28℃静置培养14天；2)将步骤1)中获得的培养物倒入50mL的无菌离心管中，11400g离心8min；3)将步骤2)中上清用滤径为0.25μm的针式过滤器过滤至新的无菌离心管中，即为粗毒素原液。

【技术特征摘要】
1.葡萄溃疡病菌粗毒素原液的制备方法，包括下述步骤：1)将葡萄溃疡病菌在PDA培养基上28℃培养48小时后，用5mm打孔器沿菌落边缘打取菌饼置于盛有100mL产毒液体培养基的500mL三角瓶中，6个菌饼/100mL培养基，28℃静置培养14天；2)将步骤1)中获得的培养物倒入50mL的无菌离心管中，11400g离心8min；3)将步骤2)中上清用滤径为0.25μm的针式过滤器过滤至新的无菌离心管中，即为粗毒素原液。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述葡萄溃疡病菌为葡萄座腔菌Botryosphaeriadothidea、Lasiodiplodiatheobromae、小新壳梭孢Neofusicoccumparvum或Diplodiaseriata。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述产毒液体培养基为改良Fries产毒液体培养基，所述改良Fries产毒液体培养基的配方为：每升中含蔗糖20g、酒石酸铵5g、硝酸铵1g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g、氯化钠0.1g、氯化钙0.13g、酵母浸膏1g，加超纯水至1L。4.一种利用权利要求1所述的粗毒素原液的进行葡萄溃疡病菌对葡萄致病力评价的方法，包括下述步骤：1)将葡萄溃疡病菌在PDA培养基上28℃培养48小时后，用5mm打孔器沿菌落边缘打取菌饼置于盛有100mL产毒液体培养基的500mL三角瓶中，6个菌饼/100mL培养基，28℃静置培养14d；2)将步骤1)中获得的培养物倒入50mL的无菌离...

【专利技术属性】
技术研发人员：燕继晔，张玮，李兴红，刘梅，富春元，邢启凯，周莹，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：北京,11