基于杆状病毒表达系统制备包裹鲤疱疹病毒II型抗原的多角体的方法技术方案

本发明专利技术涉及抗原蛋白表达技术，具体涉及基于杆状病毒表达系统制备包裹鲤疱疹病毒II型抗原的多角体的方法，通过设计重组家蚕核型多角体病毒BmNPV‑VP3‑cyHV‑polh，ORF72、ORF66、ORF81和ORF82的1‑186、993‑1197、603‑783、85‑186区域序列与家蚕质型多角体病毒结构蛋白VP3基因1‑279区域的编码序列串联融合序列由杆状病毒P10启动子控制；家蚕质型多角体蛋白基因由杆状病毒的多角体蛋白基因启动子控制。用该病毒接种家蚕或家蚕培养细胞，重组病毒表达的鲤疱疹病毒II型的抗原蛋白可包裹进家蚕质型多角体内。形成的多角体可以通过简单的差速离心实现纯化；纯化的多角体在碱性条件下裂解后，可以通过离心使多角体蛋白沉淀，而鲤疱疹病毒II型抗原留存在上清中，从而可以快速、方便地获得鲤疱疹病毒II型抗原。

【技术实现步骤摘要】
基于杆状病毒表达系统制备包裹鲤疱疹病毒II型抗原的多角体的方法
本专利技术涉及病毒基因工程
，具体涉及基于杆状病毒表达系统制备包裹鲤疱疹病毒II型抗原的多角体的方法。
技术介绍
异育银鲫鳃出血病由鲤疱疹病毒II型（CyprinidherpesvirusII，CyHV-2）感染引起，目前有关该病的防治主要从增强鱼的免疫能力、减少应激反应、混养、减少养殖密度、加强疾病的检测、及时去除患病鱼等方面进行控制。一般认为免疫预防是鱼类病毒性疾病防治最有效的方法之一。目前，鱼类的疫苗主要有灭活疫苗（死疫苗）、减毒疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗以及蛋白亚单位/DNA联合疫苗。灭活疫苗制备相对较容易，但免疫原性差，需含足够量的灭活病毒才能引起有效免疫应答，且该类疫苗不能进入主要组织相容性复合体I(MHCI)类抗原呈递途径,不能有效诱导细胞毒性T细胞（CTL）反应,因此，免疫效果相对不理想、免疫力持久性差。减毒疫苗免疫力强、作用时间长，但减毒疫苗生产成本高，有毒力返祖现象，安全性较差，有回复致病性的潜在危险。亚单位疫苗具有抗原性强、保护时间长、安全性好、制备和运输方便等优点，但是存在抗原表位丢失的不足，因此，新一代疫苗的研发方向是DNA疫苗；但至今没有有效的CyHV-2的DNA疫苗。通过基因工程生产的多抗原蛋白亚单位联合疫苗可以防治因病毒突变而导致的免疫逃逸，免疫保护效果好。目前基因工程疫苗绝大多数是通过大肠杆菌表达系统生产，尽管大肠杆菌表达系统表达外源蛋白技术相对较成熟，但获取大量的纯重组蛋白仍存在缺陷。另外由于大肠杆菌不具有翻译后的修饰系统，往往导致重组蛋白的免疫原性较差、且细胞周质中含有种类繁多的内毒素。因此，有必要寻找新的表达系统。免疫的剂型不仅影响免疫效果，也影响免疫保护期。已有研究表明，海藻酸钠载药微球作为新型缓控释制剂，可增强抗原的免疫活性。但海藻酸钠抗原微球的制备工艺较复杂，影响因素较多；质型多角体是昆虫质型多角体病毒在感染细胞内形成的一种包埋有病毒粒子的蛋白质多面体结晶。因此，通过杆状表达系统制备包裹鲤疱疹病毒II型抗原的多角体有可能作为良好的疫苗，但到目前为止，还没有相关研究报道。
技术实现思路
本专利技术的专利技术目的是提供一种基于杆状病毒表达系统制备包裹鲤疱疹病毒II型抗原的多角体的方法；用质型多角体蛋白包裹的抗原稳定性好，不易被降解；纯化包裹在质型多角体内的抗原蛋白的方法简便；无核酸污染，生物安全性较高。为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种基于杆状病毒表达系统制备包裹鲤疱疹病毒II型抗原的多角体的方法，包括下列步骤：（1）将家蚕质型多角体病毒多角体蛋白基因克隆进pFastBacDual质粒的EcoRI和XbaI之间，构建重组转移pFastBacDual-polh质粒；（2）合成融合DNA序列；所述融合DNA序列如SEQIDNO:3所示；（3）将步骤（2）的融合DNA序列克隆进步骤（1）的pFastBacDual-polh质粒的XhoI和KpnI位点，获得pFast-VP3-cyHV-polh质粒；（4）将步骤（3）的pFast-VP3-cyHV-polh质粒转化感受态细胞，涂布于含培养基的琼脂平板上，于37℃培养，挑取白色菌落，提取重组Bacmid-VP3-cyHV-polhDNA；（5）将步骤（4）的重组Bacmid-VP3-cyHV-polhDNA转染家蚕培养细胞，26～27℃培养，细胞发病后，收集细胞培养上清，获重组病毒BmNPV-VP3-cyHV-polh；（6）将步骤（5）的重组病毒BmNPV-VP3-cyHV-polh接种家蚕或家蚕培养细胞，发病后，收集家蚕血淋巴或家蚕培养细胞，纯化多角体，获包裹鲤疱疹病毒II型抗原的多角体。上述技术方案中，步骤（1）中，优选以家蚕质型多角体病毒的基因组RNA或家蚕质型多角体病毒感染的中肠组织的总RNA为模板，反转录成cDNA后，通过PCR扩增获得家蚕质型多角体病毒多角体蛋白基因。也可以通过化学方法合成，其中的pFastBacDual质粒是美国Invitrogen公司的产品，属于Bac-to-Bac（BacteriatoBaculovirus）表达系统载体。上述技术方案中，步骤（4）中，所述感受态细胞为DH10/Bac感受态细胞；所述培养基为LB培养基添加四环素、卡那霉素、庆大霉素、X-gal、IPTG得到；四环素、卡那霉素、庆大霉素、IPTG和X-gal在LB琼脂平板上的含量分别为10µg/ml、50µg/ml、7µg/ml、40µg/ml和100µg/ml。利于重组Bacmid的筛选。步骤（4）中，转染具体可以为将Bacmid-VP3-cyHV-polhDNA加入到无胎牛血清的昆虫培养基中，混匀；另取转染试剂加入到无胎牛血清的昆虫培养基中，混匀；再将前者滴加到后者中，混匀放置30分钟后，滴加到无胎牛血清的昆虫培养基，尔后转染家蚕培养细胞BmN。上述技术方案中，步骤（6）中，首先将步骤（5）的重组病毒BmNPV-VP3-cyHV-polh再次转染家蚕培养细胞，26～27℃培养，细胞发病后，收集细胞培养上清，获二代重组病毒BmNPV-VP3-cyHV-polh；然后将二代重组病毒BmNPV-VP3-cyHV-polh接种家蚕或家蚕培养细胞；所述家蚕为4～5龄幼虫或蚕蛹，可节约成本。步骤（5）获取的重组病毒BmNPV-VP3-cyHV-polh可以通过再次接种家蚕培养细胞进行扩增，获取高滴度的二代重组病毒BmNPV-VP3-cyHV-polh。用二代重组病毒接种家蚕幼虫或蚕蛹可提高接种成功率、提高蚕的发病率。纯化多角体具体可以为，取感染发病的家蚕的血淋巴，通过1000转/分和3000转/分的反复差速离心，可得到纯化的质型多角体，该多角体即为包裹鲤疱疹病毒II型抗原的多角体；或者用二代重组病毒接种家蚕培养细胞，26℃培养至细胞发病，收集家蚕培养细胞，冻融交替3～5次，通过1000转/分和3000转/分的反复差速离心，也可纯化到质型多角体。本专利技术的包裹鲤疱疹病毒II型抗原的质型多角体在37℃用碳酸钠－碳酸氢钠溶液裂解，然后用盐酸溶液调pH至7.12左右，出现大量的絮状沉淀后，用12000转/分离心，所获上清为鲤疱疹病毒II型抗原。本专利技术还公开了上述基于杆状病毒表达系统制备包裹鲤疱疹病毒II型抗原的多角体的方法制备的包裹鲤疱疹病毒II型抗原的多角体以及包裹鲤疱疹病毒II型抗原的多角体在制备异育银鲫鳃出血病免疫预防药物中的应用。进一步的，本专利技术公开了一种异育银鲫鳃出血病免疫预防药物，包括上述包裹鲤疱疹病毒II型抗原的多角体。本专利技术还公开了一种融合DNA序列，DNA序列如SEQIDNO:3所示。所述融合DNA序列可以表示为ORF72-ORF66-ORF81-ORF82-VP3融合DNA序列，其中，鲤疱疹病毒II型ORF72、ORF66、ORF81和ORF82的1-186、993-1197、603-783、85-186区域的DNA序列按ORF72、ORF66、ORF81、ORF82的次序串联，其表达蛋白具多亚单位抗原蛋白特征；该DNA序列的密码子与家蚕杆状病毒表达系统匹配，从而提高抗原蛋白的表达水平；尤其是该融合序列中ORF72、ORF66、ORF81、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于杆状病毒表达系统制备包裹鲤疱疹病毒II型抗原的多角体的方法，其特征在于，包括下列步骤：（1）将家蚕质型多角体病毒多角体蛋白基因克隆进pFastBacDual质粒的

【技术特征摘要】
1.一种基于杆状病毒表达系统制备包裹鲤疱疹病毒II型抗原的多角体的方法，其特征在于，包括下列步骤：（1）将家蚕质型多角体病毒多角体蛋白基因克隆进pFastBacDual质粒的EcoRI和XbaI之间，构建重组转移pFastBacDual-polh质粒；（2）合成融合DNA序列；所述融合DNA序列如SEQIDNO:3所示；（3）将步骤（2）的融合DNA序列克隆进步骤（1）的pFastBacDual-polh质粒的XhoI和KpnI位点，获得pFast-VP3-cyHV-polh质粒；（4）将步骤（3）的pFast-VP3-cyHV-polh质粒转化感受态细胞，涂布于含培养基的琼脂平板上，于37℃培养，挑取白色菌落，提取重组Bacmid-VP3-cyHV-polhDNA；（5）将步骤（4）的重组Bacmid-VP3-cyHV-polhDNA转染家蚕培养细胞，26～27℃培养，细胞发病后，收集细胞培养上清，获重组病毒BmNPV-VP3-cyHV-polh；（6）将步骤（5）的重组病毒BmNPV-VP3-cyHV-polh接种家蚕或家蚕培养细胞，发病后，收集家蚕血淋巴或家蚕培养细胞，纯化多角体，获包裹鲤疱疹病毒II型抗原的多角体。2.根据权利要求1所述基于杆状病毒表达系统制备包裹鲤疱疹病毒II型抗原的多角体的方法，其特征在于，步骤（1）中，以家蚕质型多角体病毒的基因组RNA或家蚕质型多角体病毒感染的中肠组织的总RNA为模板，反转录成cDNA后，通过PCR扩增获得家蚕质型多角体病毒多角体蛋白基因。3.根据权利要求1所述基于杆状病毒表达系统制备包裹鲤疱疹病毒II型抗原的多角体的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：贡成良，曹广力，胡小龙，薛仁宇，刘波，李坤，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32