一个聚合常用筛查靶标的转基因油菜SD‑rapeseed及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一个聚合常用筛查靶标的转基因油菜SD‑rapeseed及其应用，涉及包括遗传转化及转基因检测在内的生物技术领域。在本发明专利技术中，通过农杆菌介导法将常用的11个转基因筛查元件导入到常规油菜品种中双6号中，获得转基因筛查油菜SD‑rapeseed。插入11个转基因筛查元件的融合序列如SEQ NO.1。以转基因油菜SD‑rapeseed作为原材料可以制备转基因油菜筛查检测通用基体标准物质及基因组DNA标准物质。本发明专利技术适用于转基因油菜筛查检测及筛查检测标准物质的制备，克服了制备质粒标准物质容易污染环境的缺陷。

【技术实现步骤摘要】
一个聚合常用筛查靶标的转基因油菜SD-rapeseed及其应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一个聚合常用筛查靶标的转基因油菜SD-rapeseed及其应用，具体地说，是通过遗传转化获得的聚合11个常用筛查靶标的转基因油菜及其在转基因标准物质制备和转基因检测中的应用。
技术介绍
自转基因作物大规模商业化以来，转基因生物的安全性问题一直备受社会各界关注，为此，包括中国、欧盟、日本和韩国等在内的50多个国家和地区纷纷颁布实施转基因生物安全管理法律法规；为了保护消费者的知情权，对转基因产品纷纷实施标识制度，并规定了标识阈值。转基因标识制度的实施需要开发建立转基因检测方法，根据检测特异性的不同，目前的检测方法可分为筛查检测方法、构建特异性检测方法和转化事件特异性检测方法。其中，筛查检测方法检测的靶标是转基因作物中最常见的通用元件，如CaMV35启动子、NOS终止子等。因此，筛查检测是转基因检测的第一步，检测机构通常根据筛查检测的结果，初步判定样品中是否含有转基因成分。任何检测工作的开展、检测结果的质量控制和溯源都离不开标准物质。无论是目前在研的标准物质还是在售的标准物质，绝大部分都是基于转化事件特异性检测的需要研制的，没有满足转基因筛查检测需求的标准物质。在转基因筛查检测中，由于缺乏标准物质，只能利用混合的转化事件特异性检测用标准物质作为参照标准。但利用转化事件特异性检测用标准物质的混合物进行转基因筛查存在多种问题：1)基因工程研究常用的潮霉素抗性基因HPT等转基因元件没有相应的标准物质；2)部分筛查元件在不同的转化事件中重复出现，导致阳性对照不同元件拷贝数不一致，难以准确反映检测的灵敏度；3)不同转基因成分DNA提取效率存在差异，造成检测灵敏度判断的误差。如果不用混合的转基因材料作为阳性对照，需要根据检测的靶标设置多个阳性对照，增大了提取DNA的工作量，而且为了考察DNA质量，还要多设置内标准基因的反应，进一步提高了检测成本，增大了检测的工作量，为检测工作造成不便。虽然用聚合检测靶标的质粒作为标准物质可以解决缺乏通用筛查标准物质缺乏的难题，但质粒标准物质存在着容易污染检测环境的问题。结合上述考虑，以解决缺乏转基因筛查检测用标准物质这一难题为切入点，将常用的转基因筛查元件转化到油菜中，创制转基因油菜筛查检测标准物质候选物，研制转基因油菜筛查检测基体标准物质或基因组DNA标准物质。与质粒标准物质相比，基因标准物质或基因组DNA标准物质没有易于污染环境的缺陷。经对现有专利和其他文献的检索，尚未发现任何关于转基因油菜筛查检测通用标准物质研制和应用的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的就在于提供一个聚合常用筛查靶标的转基因油菜SD-rapeseed及其应用。本专利技术的目的是这样实现的：通过将常用的筛查元件聚合插入到常规油菜中，创制一种携带常用筛查元件的转基因油菜；以转基因油菜为候选物制备转基因油菜筛查检测通用标准物质，通过研制转基因油菜筛查检测通用标准物质解决我国转基因油菜筛查检测中缺乏标准物质的难题。一、获得聚合常用筛查靶标的单拷贝转基因油菜SD-rapeseed的方法通过遗传转化将常用的11个筛查元件整合到转基因油菜中，以期获得可以制备转基因油菜筛查检测通用标准物质的候选物，转基因筛查检测标准物质不仅用做筛查检测时的阳性对照，还用于检测方法包括灵敏度等在内的各项技术参数的评价，因此标准物质中含有的各个检测靶标必须要有稳定的拷贝数。本专利技术采用数字PCR方法，鉴定各检测靶标的拷贝数，筛选出各检测靶标均为单拷贝的转基因油菜单株，并自交纯合，命名为SD-rapeseed，用作转基因油菜筛查检测通用标准物质制备的候选物。具体地说，本方法包括下列步骤：1、油菜的遗传转化以常规油菜品种中双6号作为遗传转化材料，采用农杆菌介导法，将聚合了11个常用的转基因筛查靶标，包括3个启动子P-35S(SEQNO.2)、P-FMV35S(SEQNO.3)和P-NOS(SEQNO.4)，4个标记基因Bar(SEQNO.5)、NPTII(SEQNO.6)、HPT(SEQNO.7)和Pmi(SEQNO.8)，4个终止子T-NOS(SEQNO.9)、T-35S(SEQNO.10)、T-g7(SEQNO.11)和T-e9(SEQNO.12)的T-DNA序列转化到油菜中，获得T0代转基因油菜植株。T-DNA序列中11个筛查元件的构建图谱见图1。获得T0代转基因油菜后，先初步筛选出阳性植株；然后采用转基因检测标准或文献中发布的各个筛查元件的检测引物或引物/探针组合对初步筛选出的阳性植株进行鉴定，筛选出聚合所有筛查元件且插入序列完整的阳性转基因植株。2、单拷贝转基因油菜单株的鉴定甘蓝型油菜是异源四倍体，基因组通常表示为AACC；选用CruA基因作为油菜的内标准基因，该基因在单倍体基因组中是单拷贝，而且A基因组和C基因组都含有CruA基因，因此CruA基因在异源四倍体油菜中是4个拷贝；T0代转基因油菜中外源基因随机插入到油菜的A或C基因组中，分别1到多个拷贝不等；对于T0代转基因植株，外源基因均处于杂合态，如果外源基因以单拷贝插入到油菜基因组中，异源四倍体的转基因油菜只有其中的一个单倍体含有外源基因；因此对于T0代单拷贝转基因油菜，外源基因与内标准拷贝数的比值为1/4；基于该原理，利用伯乐公司QX200微滴式数字PCR(QX200DropletDigitalTMPCR)系统，分别对阳性转基因植株中的筛查元件和内标准基因进行扩增和计数，统计外源片段与作物内标准基因的比值；从11个外源靶标中随机选择HPT代表外源基因拷贝数，选择内标准基因CruA表征油菜的基因组；通过检测HPT和内标准基因CruA的拷贝数的比值，鉴定出T0代中HPT基因为单拷贝的转基因油菜植株。在外源基因整合到受体基因组的过程中可能会发生外源基因的缺失、重复等重组；转基因检测标准物质要求每个检测靶标都要有清晰稳定的拷贝数；因此对于T0代鉴定出的HPT单拷贝植株还要进行HPT以外的其他元件的拷贝数检测；利用微滴数字PCR分别检测其他10个外源元件与内标基因CruA的比值，鉴定出所有外源基因均为单拷贝的纯合单株。3、单拷贝纯合转基因油菜单株的鉴定将T0代单拷贝转基因植株自交，收获并种植T1代种子；每个单株的T1代约种植30棵；通过定性PCR检测，拔除阴性植株并记录；采用微滴式数字PCR系统，分别对T1代植株中的筛查元件HPT和作物内标基因CruA的拷贝数进行检测，通过二者的比值筛选出纯合转基因单株；油菜纯合体比值约为约为1：2，杂合体比值约为1：4。结合植株长势、结实情况，选择1株综合性状最好的单拷贝纯合转基因单株，作为转基因油菜筛查检测标准物质制备的候选物，命名为SD-rapeseed。二、转基因油菜SD-rapeseed的特征1、转基因油菜SD-rapeseed含有11个常用的转基因筛查靶标，碱基序列如SEQNO.1所示，包括3个启动子P-35S、P-FMV35S和P-NOS，4个标记基因Bar、NPTII、HPT和Pmi，4个终止子T-NOS、T-35S、T-g7和T-e9。2、转基因油菜SD-rapeseed为纯合单拷贝转基因植株，11个筛查元件均为单拷贝，而且已纯合。3、转基因油菜本文档来自技高网...

【技术保护点】
一个聚合常用筛查靶标的转基因油菜SD‑rapeseed，其特征在于：①携带11个常用的转基因筛查靶标，序列如SEQ NO.1，包括3个启动子P‑35S、P‑FMV35S和P‑NOS，4个标记基因Bar、NPTII、HPT和Pmi，4个终止子T‑NOS、T‑35S、T‑g7和T‑e9；②转基因油菜中只有一个读码框P‑NOS‑NPTII‑T‑NOS正常表达，其他基因或元件均无活性。

【技术特征摘要】
1.一个聚合常用筛查靶标的转基因油菜SD-rapeseed，其特征在于：①携带11个常用的转基因筛查靶标，序列如SEQNO.1，包括3个启动子P-35S、P-FMV35S和P-NOS，4个标记基因Bar、NPTII、HPT和Pmi，4个终止子T-NOS、T-35S、T-g7和T-e9；②转基因油菜中只有一个读...

【专利技术属性】
技术研发人员：武玉花，李俊，李允静，曾新华，刘芳，吴刚，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42